紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥對(duì)荷S180實(shí)體瘤小鼠的抑瘤作用

陳 凝， 劉寶瑞

紫杉醇是從短葉紅豆杉樹(shù)皮中提取和純化得到的一種對(duì)許多類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的提取物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是紫杉烷類(lèi)中一種四環(huán)二萜類(lèi)化合物。其通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞微管蛋白、停止有絲分裂過(guò)程而中斷細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［1-2］。紫杉醇難溶于水，目前紫杉醇注射劑多以聚氧乙烯蓖麻油和無(wú)水乙醇(1∶1)輔助溶劑增加水溶性，前者有促進(jìn)組胺釋放的作用，常引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，臨床使用前需給予抗過(guò)敏藥物并進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，且需緩慢滴注。采用脂質(zhì)體為載體，既解決了紫杉醇難溶于水的問(wèn)題，又因不再使用聚氧乙烯蓖麻油和無(wú)水乙醇為溶媒而避免了對(duì)人體的毒性反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)［3-4］。

脂質(zhì)體皮下注射后表現(xiàn)出良好的淋巴靶向性和緩釋性［5-7］。直徑小于100 nm的脂質(zhì)體能直接進(jìn)入淋巴管，然后到達(dá)區(qū)域淋巴結(jié)，淋巴吸收可達(dá)70%左右;直徑較大的脂質(zhì)體則沉積在注射部位，逐漸降解后，被其包封的藥物緩慢釋放進(jìn)入血液循環(huán)(見(jiàn)圖1)。

圖1 脂質(zhì)體皮下給藥后藥物分布示意圖

游離藥物瘤體內(nèi)注射后，由于分子粒徑小，藥物容易從注射部位泄漏;而包裹了化療藥物的脂質(zhì)體瘤體內(nèi)注射后，由于分子粒徑較大可以在腫瘤局部維持較高的藥物濃度并緩慢解放，繼而減少全身副作用［8］。用99m锝標(biāo)記的脂質(zhì)體瘤體內(nèi)直接注射后瘤體和瘤周的濃度可達(dá)給藥總量的50%左右，20 h后瘤體和瘤周的濃度仍有給藥總量的40%，而未經(jīng)脂質(zhì)體包裹的99m锝在瘤內(nèi)注射20 h后瘤體和瘤周的濃度只有給藥總量的19%［9］。已有試驗(yàn)證明瘤體內(nèi)直接注射IL-2質(zhì)粒DNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物可抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)［10］，而紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)注射后對(duì)于腫瘤的控制作用國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道，據(jù)此，我們制備了紫杉醇脂質(zhì)體，并觀察其對(duì)昆明鼠瘤體內(nèi)給藥后的療效。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 大豆磷脂(北京海淀區(qū)生物科技公司)，膽固醇(北京海淀區(qū)生物科技公司)，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPE-PEG2000，西安力邦制藥有限公司)，紫杉醇注射液(北京四環(huán)制藥有限公司)，紫杉醇原藥(北京協(xié)和藥廠饋贈(zèng))，維生素E注射液(上海市第九制藥廠)，小牛血清(Amersco，美國(guó))，胎牛血清(Amersco，美國(guó))，1640培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))，二甲基亞砜(DMSO)、甲醇、二氯甲烷、乙睛均為分析純(上海中興化學(xué)品有限公司)。

JY92-II型超聲波粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，透析袋(8 000，12 000-14 000，Sorua，德國(guó))，超濾膜(Ultracel PL，10.000 NMWL，Millipore，美國(guó))。85-2型恒溫磁力攪拌器(常州國(guó)華儀器廠)，2XE-1真空泵(奉化市飛馬電機(jī)廠)，冷凍干燥機(jī)(上海儀表集團(tuán))，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，超濾器(Stirred Cells 8050，Millipore，美國(guó))，UV3100 紫外分光光度計(jì)(Shimadzu，日本)，恒溫槽(ELLY4，TOKYO Rikaaikai，日本)，Zetasizer 3000激光粒徑散射儀(MALVERN，英國(guó))，LC29A高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)，SPD210AVP紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(Shimadzu，日本)。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，體重(20±2)g，雄性，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 小鼠移植瘤株 小鼠 S180細(xì)胞株從中國(guó)藥科大學(xué)藥物研究室取種后種植在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物房昆明鼠體內(nèi)傳代。

1.4 紫杉醇脂質(zhì)體的制備及檢測(cè) 采用逆向蒸發(fā)法+超聲法制備紫杉醇脂質(zhì)體。經(jīng)粒徑測(cè)定儀測(cè)定脂質(zhì)體平均粒徑為(282.4±8.94)nm，多分散性為0.243。紫杉醇脂質(zhì)體的包封率為91%［11］。

1.5 實(shí)體瘤模型的建立 選用雄性成熟昆明種小鼠20只，分別在其右后肢近腹側(cè)皮下種植S180細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)1×107/mL)0.1 mL。7天后100%成瘤。

1.6 給藥方法 20只雄性昆明種小鼠皮下種植S180細(xì)胞，7天成瘤后隨機(jī)分為4組，每組5只，分別為生理鹽水對(duì)照組、空白脂質(zhì)體組、紫杉醇注射液組、紫杉醇脂質(zhì)體組。紫杉醇注射液、紫杉醇脂質(zhì)體均用生理鹽水稀釋至含紫杉醇劑量1 mg/mL。紫杉醇注射液組、紫杉醇脂質(zhì)體組給藥劑量為10 mg/kg，生理鹽水對(duì)照組、空白脂質(zhì)體組為等容積量生理鹽水和等容積量空白脂質(zhì)體懸液，分別瘤體內(nèi)注射，給藥時(shí)間為隨機(jī)分組后第0、3、6、9天。每次給藥后觀察小鼠的精神狀況、毛色、活動(dòng)度，同時(shí)測(cè)量瘤徑，稱(chēng)重。在給藥結(jié)束后觀察3天，第4天經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢取血，隨即處死動(dòng)物，解剖剝離腫瘤，測(cè)量瘤徑，計(jì)算瘤體積并稱(chēng)重。部分血樣進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)檢查，部分血樣離心后取上清用于肝功能檢測(cè)。根據(jù)以下公式計(jì)算抑瘤率:腫瘤抑瘤率=［1－給藥組平均瘤重(體積)/對(duì)照組平均瘤重］×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析。采用Stata 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05時(shí)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 荷瘤鼠在給藥期間及觀察期內(nèi)無(wú)毛色發(fā)暗、脫毛等改變;給藥期間均存活，活動(dòng)均自如。給藥后體重均有增加。從動(dòng)物體重變化可以看出，紫杉醇脂質(zhì)體組給藥前后動(dòng)物體重增長(zhǎng)較紫杉醇注射液組更接近生理鹽水對(duì)照組(見(jiàn)表1)。

表1 荷瘤鼠體重的變化(g，±s)

表1 荷瘤鼠體重的變化(g，±s)

注:*12 d與對(duì)照組比較P＞0.05，#12 d與對(duì)照組比較P＜0.05，△12 d與對(duì)照組比較P＞0.05;12 d紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組比較，P＜0.05;12 d紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組比較，P＞0.05。

0 d 3 d 6 d 9 d 12 d P 值1 38.41 ±9.13空白脂質(zhì)體組 21.20 ±2.63 24.13 ±3.22 29.21 ±4.11 34.22 ±6.01 39.00 ±8.05 ＞0.05*紫杉醇注射液組(10 mg/kg) 21.32 ±2.26 23.74 ±2.97 27.32 ±3.77 30.41 ±5.27 33.52 ±6.15 ＜0.05#紫杉醇脂質(zhì)體組(10 mg/kg) 20.81 ±2.45 23.80 ±3.18 29.14 ±5.01 33.83 ±6.92 38.41 ±7.98 ＞0.05生理鹽水對(duì)照組 20.71 ±2.51 23.91 ±3.11 28.60 ±5.21 33.70 ±7.8△

2.2 紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥的抑瘤效果 從表2可以看出，與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇注射液組的質(zhì)量抑瘤率為36.42%(P＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的質(zhì)量抑瘤率為57.47%(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組的質(zhì)量抑瘤率為2.59%(P＞0.05);空白脂質(zhì)體組與紫杉醇脂質(zhì)體組比較，P＜0.01。紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射組比較，P＜0.05。從表3可以看出，與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇注射液組的體積抑瘤率為(47.55 ±3.12)%(P ＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的體積抑瘤率為(65.49±4.53)%(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組的體積抑瘤率為(3.65±0.62)%(P＞0.05);空白脂質(zhì)體組與紫杉醇脂質(zhì)體組比較，P＜0.01。紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射組比較，P＜0.05。紫杉醇脂質(zhì)體組的抑瘤效果優(yōu)于紫杉醇注射液組。瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠體積變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠解剖后瘤體標(biāo)本照片見(jiàn)圖3。

表2 荷瘤鼠移植瘤質(zhì)量抑瘤率(%)

表3 荷瘤鼠移植瘤體積抑瘤率(%，±s)

表3 荷瘤鼠移植瘤體積抑瘤率(%，±s)

注:* ，#，△ 均為與對(duì)照組比較結(jié)果;紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組比較，P＜0.05;紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組比較，P＜0.01。

動(dòng)物數(shù)(只) 死亡數(shù)(只) 瘤體積(mm3，±s)前后腫瘤體積抑制率(%) P值生理鹽水對(duì)照組 5 0 175±8.45 2 162±123.40空白脂質(zhì)體組 5 0 169±7.98 2 083±135.80 3.65±0.62 ＞0.05*紫杉醇注射液組(10 mg/kg) 5 0 180 ±8.21 1 134 ±78.20 47.55 ±3.12 ＜0.05#紫杉醇脂質(zhì)體組(10 mg/kg) 5 0 178 ±8.53 746 ±61.40 65.49 ±4.53 ＜0.01△

圖2 瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠腫瘤體積變化曲線(xiàn)

2.3 紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠外周血分類(lèi)改變 從表4可以看出，與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇注射液組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低(P＜0.05)，血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異(P＞0.05);與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇脂質(zhì)體組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)略低于生理鹽水對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)與生理鹽水對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05);紫杉醇注射液組比較與紫杉醇脂質(zhì)體組比較，前者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于后者(P＜0.05)。

圖3 瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠解剖后腫瘤體積變化圖片

表4 荷瘤鼠外周血分類(lèi)檢查結(jié)果

2.4 紫杉醇脂質(zhì)體瘤體內(nèi)給藥后荷瘤鼠肝功能檢查結(jié)果 從表5可以看出，與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇注射液組及紫杉醇脂質(zhì)體組ALT、AST值均略高于生理鹽水對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組間比較以及紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組間比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表5 荷瘤鼠肝功能檢查結(jié)果(mol/L，±s)

表5 荷瘤鼠肝功能檢查結(jié)果(mol/L，±s)

注:*，#，△均為與對(duì)照組比較的結(jié)果;紫杉醇脂質(zhì)體組與紫杉醇注射液組比較，紫杉醇脂質(zhì)體組與空白脂質(zhì)體組比較，均P＞0.05。

ALT(mol/L) P值 AST(mol/L) P值生理鹽水對(duì)照組 60.87 ±6.91 71.67 ±5.82空白脂質(zhì)體組 62.31±7.36 ＞0.05* 70.54±6.91 ＞0.05*紫杉醇注射組(10 mg/kg) 72.64±10.25 ＞0.05# 76.97±11.07 ＞0.05#紫杉醇脂質(zhì)組(10 mg/kg) 73.77±9.74 ＞0.05△ 75.55±9.43 ＞0.05△

3 討論

傳統(tǒng)的化療藥物是通過(guò)各種途徑給藥后，達(dá)到一定的血藥濃度分布于全身而產(chǎn)生治療作用。這種治療方法最大的缺陷是缺乏選擇性。而脂質(zhì)體對(duì)腫瘤組織具有靶向性和緩釋性，在腫瘤組織中能保持較高的藥物濃度，將抗腫瘤藥物選擇性地分布于腫瘤病變部位，降低其對(duì)正常組織的毒副作用，從而提高藥物利用率［12-15］。

在對(duì)鼠S180實(shí)體瘤模型瘤體內(nèi)給藥中，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇注射液組的質(zhì)量抑瘤率為36.42%(P＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的質(zhì)量抑瘤率為57.47%(P＜0.01);與生理鹽水對(duì)照組比較，紫杉醇注射液組的體積抑瘤率為(47.55±3.12)%(P ＜0.05)，紫杉醇脂質(zhì)體組的體積抑瘤率為(65.49 ±4.53)%(P ＜0.01)。結(jié)果表明，從抑制腫瘤質(zhì)量及腫瘤體積兩方面統(tǒng)計(jì)，紫杉醇脂質(zhì)體的效果優(yōu)于紫杉醇注射液，其可能的原因在于脂質(zhì)體瘤體內(nèi)注射后，在瘤體和瘤周可以保持長(zhǎng)時(shí)間的高濃度，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng);另一方面，由于脂質(zhì)膜的特異性作用，紫杉醇可以穩(wěn)定停留并蓄積于腫瘤組織處，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)揮細(xì)胞毒作用。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)于荷瘤鼠外周血白細(xì)胞的毒性小于紫杉醇注射液，這可能與紫杉醇脂質(zhì)體中藥物多集中于瘤組織內(nèi)或瘤周組織，進(jìn)入全身血液循環(huán)相對(duì)較少有關(guān)。周衛(wèi)等［16］研究紫杉醇脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的組織分布情況，發(fā)現(xiàn)紫杉醇脂質(zhì)體在肝臟、肺、脾臟等組織中分布較多。考慮到紫杉醇脂質(zhì)體可能造成的器官毒性，本實(shí)驗(yàn)比較了各組的主要肝功能指標(biāo)。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)所用的劑量下，紫杉醇脂質(zhì)體組的小鼠肝功能與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，與紫杉醇注射液組之間也未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。紫杉醇脂質(zhì)體在體內(nèi)分布的改變并未增加其對(duì)肝臟的毒性。

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