地塞米松對肺纖維化小鼠細(xì)胞因子及羥脯氨酸的影響

史可云,謝 婧

(江蘇省宜興人民醫(yī)院內(nèi)科,江蘇宜興,214200)

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種由免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病。近年來的研究表明,細(xì)胞因子的紊亂與肺間質(zhì)纖維化有密切關(guān)系。多數(shù)研究者認(rèn)為,炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子在間質(zhì)性肺炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。多種細(xì)胞因子形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),通過影響肺泡上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡,使細(xì)胞外基質(zhì)的沉積增多,抑制纖溶系統(tǒng)的激活等多種途徑,最終促使肺纖維化持續(xù)進(jìn)展[1-2]。作者觀察了地塞米松對BLM致肺纖維化小鼠血清中IFN-γ、IL-4、TNF-α含量的影響及羥脯氨酸的變化,以揭示細(xì)胞因子和羥脯氨酸在肺纖維化形成過程中的意義,對肺纖維化的治療作用及其可能機(jī)制,為臨床治療肺纖維化提供一條新的途徑。

1 材 料

清潔級小鼠30只,雌雄各半,體質(zhì)量(25±1.2)g;購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;地塞米松品購自SIGMA公司;鹽酸博萊霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;小鼠 IFN-γ、IL-4、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;羥脯氨酸(HYP)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方 法

2.1 動物分組及動物模型的制備

昆明小鼠隨機(jī)分為:空白對照組、博萊霉素(BLM)組、地塞米松(DXM)組,每組10只。用氣管內(nèi)注入BLM(5 mg/kg)制肺纖維化模型,空白組除外。從造模次日開始,空白對照組、BLM 組分別每天灌胃生理鹽水(1 mL/kg),地塞米松(DXM)組每日灌胃地塞米松(0.45 mg/kg)。

2.3 測定血清中IFN-γ、IL-4、TNF-α的含量

治療第14天和第28天各組隨機(jī)分別取5只小鼠,心臟取血處死,分離血清,采用ELISA試劑盒法進(jìn)行檢測。

2.4 羥脯氨酸(HYP)含量測定

精確稱取肺組織濕重40 mg放入試管中,準(zhǔn)確加水解液1 mL,混勻,置入玻璃磨口試管中加蓋后沸水水浴水解20 min,水解10 min時(shí)混勻1次。調(diào)pH值至6.0～6.8。將各試管流水冷卻后各管加指示劑1滴,搖勻;各試管準(zhǔn)確加入甲液1.0 mL,混勻,此時(shí)溶液變?yōu)榧t色。吸取調(diào)乙液向各管內(nèi)逐滴小心加入混勻,直至液體中指示劑的顏色變成黃綠色。然后加蒸餾水至10mL,混勻。取4 mL稀釋的水解液,3 500 r/min,離心10 min,取上清1 mL作測定用。按測定操作采用ELISA試劑盒法進(jìn)行檢測。在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管中分別加入相應(yīng)試劑,放入60℃水浴15 min,冷卻后,3 500 r/min離心10 min,取上清,用752紫外光柵分光光度計(jì)(波長為550 nm,1 cm比色皿,用蒸餾水調(diào)零)測定各管吸光度(A)值。根據(jù)公式計(jì)算HYP含量。HYP含量(μ g/mg濕重)=(測定管A值-空白管A值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 μ g/mL)×水解液總體積(10 mL)÷組織濕重(mg)。

3 結(jié) 果

3.1 小鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α含量比較

與空白組比較,模型第14天和第28天組血清IL-4、TNF-α含量顯著增加(P<0.05),IFN-γ量顯著減少(P<0.05);地塞米松組與BLM 組比較,14 d和28 d組血清IL-4、TNF-α含量顯著增加(P<0.01),IFN-γ量顯著減少(P<0.05)。見表1。

表1 地塞米松對小鼠血清中細(xì)胞因子的影響( x±s,n=5)

3.2 小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量的影響

BLM組各時(shí)間點(diǎn)Hyp含量當(dāng)14 d和28 d時(shí)高于對照組,有明顯增加(P<0.01)。DXM與BLM 組Hyp相比較,Hyp含量于14和28 d有明顯下降(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠肺組織勻漿中羥脯氨酸含量的變化(μ g/mg, x ±s,n=5)

4 討 論

肺纖維化是多種肺部疾病的共同引起的。誘發(fā)肺纖維化的病因眾多,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,感染、粉塵吸入、使用某些藥物均可導(dǎo)致肺纖維化。雖然不同的病因所導(dǎo)致的纖維化各有特點(diǎn),但主要特征性病變均為肺成纖維細(xì)胞大量增生及細(xì)胞因子。由于細(xì)胞因子失衡可能主要參與了早期肺泡炎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3-4]。

肺纖維化的實(shí)驗(yàn)動物模型有多種建立方法,包括抗肺組織抗體、博萊霉素、放射線、百草枯病毒、高濃度氧等均可誘發(fā),而且均能較好地反映肺纖維化的發(fā)病過程及病理特征。TNF-α是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子,與肺纖維化和間質(zhì)性炎癥密切相關(guān),可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞等靶細(xì)胞的增殖與分化[5-6]。IFN-γ具有抗纖維化作用,TNF-α、IL-4具有促進(jìn)纖維化作用。刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化,并在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[7]。HYP是組成機(jī)體膠原蛋白的一種特有的氨基酸,幾乎所有HYP都存在于膠原中,因此組織中HYP為膠原纖維所特有,其含量可作為膠原組織代謝的重要指標(biāo),因此膠原的沉積可用HYP的含量來反映,亦可作為藥物療效指標(biāo)[8]。

本實(shí)驗(yàn)選用地塞米松對肺纖維化小鼠進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組:肺纖維化與對照組比較,第14天和第 28天時(shí) TNF-α、IL-4細(xì)胞因子有明顯升高,IFN-γ與對照組差異無顯著性(P>0.05)。干預(yù)后的 14 d和28 d時(shí)TNF-α、IL-4細(xì)胞因子也有明顯升高,而IFN-γ有所下降。同時(shí)模型組與干預(yù)后比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。作用第7天后HYP含量差異無顯著性,作用第14天和28 d后HYP含量比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。提示故本研究主要選擇在14 d和28 d觀察地塞米松對細(xì)胞因子和羥脯氨酸異常變化的影響。使得Th1/Th2細(xì)胞因子失衡是肺纖維化的發(fā)病機(jī)制之一。即在特發(fā)性肺纖維化中Th2型細(xì)胞因子反應(yīng)占優(yōu)勢,Th1型細(xì)胞因子相對不足促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。使用地塞米松能夠調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞因子失衡[9-11]。早期應(yīng)用地塞米松可使BLM致大鼠肺纖維化模型血清中TNF-α水平下調(diào),推測地塞米松可能對TNF-α有阻斷作用,從而起到干預(yù)肺纖維化的作用。因此地塞米松有良好的防治纖維化的作用,地塞米松能減輕肺纖維化大鼠肺組織肺泡炎及肺纖維化程度,調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子失衡、TNF-α水平可能是地塞米松防治肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制之一。

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