牛睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)與大容量批量?jī)龃嬖囼?yàn)

向 敏，陳志華，高其雙，黃海軍，陶弼菲，占才耀，王連芳，李 杰

（湖北省武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430065）

牛睪丸原代細(xì)胞是目前生產(chǎn)細(xì)胞型豬瘟弱毒疫苗的最主要細(xì)胞源。全國(guó)每年用于生產(chǎn)豬瘟弱毒疫苗的牛睪丸約為70萬對(duì)，但牛的產(chǎn)仔具有相對(duì)嚴(yán)格的季節(jié)性，且同一個(gè)牛場(chǎng)每天的睪丸產(chǎn)量是極其有限的。這給疫苗生產(chǎn)廠家批量收集睪丸以及調(diào)劑生產(chǎn)周期等方面帶來了困難。另外，經(jīng)常不斷的從外界送入生鮮睪丸組織，增加了藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）車間的污染頻率，因此，進(jìn)入GMP車間用于生產(chǎn)豬瘟疫苗的牛睪丸細(xì)胞最好是經(jīng)檢測(cè)無污染并能產(chǎn)出高效價(jià)病毒的合格細(xì)胞。但是，牛睪丸細(xì)胞傳代次數(shù)是有限的。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，牛睪丸細(xì)胞接種豬瘟病毒只適合傳5代次［1］。很明顯，以現(xiàn)有的凍存管凍存技術(shù)凍存牛睪丸細(xì)胞等待檢測(cè)結(jié)果，再將其解凍用于大容量轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是不可能的，只有采取大容量批量?jī)龃婕夹g(shù)建立可靠的健康牛睪丸原代細(xì)胞貯備庫(kù)才可以做到這一點(diǎn)，目前，國(guó)內(nèi)外尚無類似的成熟技術(shù)。本試驗(yàn)從傳統(tǒng)制作方法的改進(jìn)，胰酶的消化以及大容量批量?jī)龃娴确矫娓倪M(jìn)牛睪丸細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)，為研究豬瘟細(xì)胞型弱毒疫苗的規(guī)范化生產(chǎn)，提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑 Hank′s液：按標(biāo)準(zhǔn)配方自配。DMEM高糖培養(yǎng)基原液，購(gòu)自北京清大天一科技有限公司，原液按使用說明書配制，另加入10%血清即成為DMEM高糖工作液。細(xì)胞凍存液由45%DMEM原液、45%新生牛血清、10%DMSO混合均勻制得。分別裝入200mL血清袋中，8KGY劑量下輻照5h，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牛睪丸的采集 剛出生的奶公牛，運(yùn)入潔凈手術(shù)室，按照常規(guī)操作快速將陰囊皮膚環(huán)切，同時(shí)切斷皮下筋膜、附睪、血管等組織，用一根細(xì)繩在術(shù)者兩手手指尖離切口約1cm處結(jié)扎，用浸滿碘酊的棉花條沿切口向后將整個(gè)陰囊包裹，裝入采樣袋中，放入裝有冰袋的泡沫箱內(nèi)存放備用。

1.3 原代細(xì)胞制作

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇3對(duì)牛睪丸作為試驗(yàn)對(duì)象，分別用含有Hank′s液的2.5%胰蛋白酶+0.02%EDTA，5.0%胰蛋白酶+0.02%EDTA以及2.5%胰蛋白酶三種不同消化方法分離牛睪丸細(xì)胞。

1.3.2 操作方法 從樣品袋中取出陰囊，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌操作，用眼科鑷子夾住露于陰囊切口外的附睪或睪丸系膜組織，將睪丸放入盛有 Hank′s液的平皿中，用含有雙抗的Hank′s液反復(fù)洗滌，再將睪丸放入另一干燥平皿內(nèi)，用眼科剪剪去睪丸表皮，繼續(xù)用含雙抗的Hank′s液洗滌1～2次，將洗好的去皮睪丸稱重，然后將睪丸組織剪成厚約0.2 cm的碎片，轉(zhuǎn)入一個(gè)裝有玻璃珠并經(jīng)高溫滅菌處理的抽濾瓶中，繼續(xù)向抽濾瓶中加入細(xì)胞消化液直至浸沒全部玻璃珠及其上放置的睪丸組織，放置于37℃水浴鍋中消化30min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)慢慢將消化液倒出，再向瓶中加入DMEM工作液進(jìn)行中和，倒去培養(yǎng)基，強(qiáng)烈振搖，使消化后的睪丸細(xì)胞充分從組織塊上分離出來，再用培養(yǎng)基沖洗玻璃珠，洗液即成為細(xì)胞懸液，倒入細(xì)胞瓶中，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 凍存與解凍操作 當(dāng)睪丸細(xì)胞分離后，按照每3.5g睪丸組織加入200mL凍存液的標(biāo)準(zhǔn)制成細(xì)胞懸液，分裝入凍存袋中，每袋200mL，將其分別放入一適當(dāng)大小的泡沫箱內(nèi)和鐵盒內(nèi)，并放入-80℃的冰箱中讓其自然凍結(jié)。另取少量細(xì)胞懸液放入若干個(gè)凍存管，按照常規(guī)凍存方法作檢測(cè)備用樣品。

分別在細(xì)胞凍存后的第30、120、360天取部分細(xì)胞進(jìn)行解凍。將泡沫箱內(nèi)的細(xì)胞袋和鐵盒中的細(xì)胞袋解凍離心后輕輕移入超凈工作臺(tái)內(nèi)倒出上清液，用DMEM工作液重懸細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)，將重懸細(xì)胞液導(dǎo)入10000mL的轉(zhuǎn)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)基至1000mL，于37℃下轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。對(duì)照組按傳統(tǒng)方法進(jìn)行解凍培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞存活率檢測(cè) 細(xì)胞懸液和臺(tái)盼藍(lán)染液按1∶1（V∶V）的比例混合，染色2～3min后在倒置顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并區(qū)分出活細(xì)胞和死細(xì)胞以計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6 細(xì)胞貼壁率檢測(cè)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)8h后，在轉(zhuǎn)瓶顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并取少量培養(yǎng)液樣品，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代細(xì)胞 見表1。

表1 牛睪丸細(xì)胞特征

從表1中可以看出，牛睪丸細(xì)胞經(jīng)2.5%胰蛋白酶消化的細(xì)胞活力最高。

2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 見表2。

從表2中，我們可以看出，改良后的凍存方法特別是泡沫盒凍存和傳統(tǒng)的凍存方法細(xì)胞復(fù)蘇活力差別不大，但是，由于牛睪丸細(xì)胞傳代次數(shù)的限制性，我們最終選用泡沫箱凍存。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng) 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)8h后，均已貼壁完好，部分細(xì)胞已開始拉伸變長(zhǎng)，24h后，細(xì)胞已全部變成成纖維細(xì)胞樣，個(gè)別未分散的細(xì)胞團(tuán)則呈島狀生長(zhǎng)，向周邊呈放射狀生長(zhǎng)出纖維樣細(xì)胞。48h后，細(xì)胞間已基本無間隙，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁（見圖1），可用于傳代。

從表3中可以看出，改良后的凍存方法特別是泡沫盒凍存的細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)上細(xì)胞貼壁率最高，而用傳統(tǒng)的方法和鐵盒凍存細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁率上明顯降低。

3 討論

圖1 復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)48h牛睪丸細(xì)胞形態(tài)

表3 復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁8 h生長(zhǎng)率 （%）

牛睪丸原代細(xì)胞是豬瘟弱毒細(xì)胞性疫苗生產(chǎn)的主要細(xì)胞源，目前國(guó)內(nèi)普遍采用生鮮牛睪丸，不僅采集成本高，而且對(duì)GMP車間污染的可能性以及篩選合格的睪丸組織所造成的生產(chǎn)資源浪費(fèi)都較大，本試驗(yàn)將牛睪丸原代細(xì)胞進(jìn)行大容量批量?jī)龃?，其解凍存活率與生鮮原代細(xì)胞無顯著差異，這為建立專業(yè)化牛睪丸原代細(xì)胞貯備庫(kù)提供了技術(shù)參考。

豬瘟弱毒病毒的培養(yǎng)采用的是牛睪丸原代細(xì)胞帶毒培養(yǎng)技術(shù)，其最優(yōu)收毒代次為3～5代，這要求細(xì)胞的起始培養(yǎng)單位不能太?。?］，以免細(xì)胞達(dá)到工廠化生產(chǎn)培養(yǎng)單位所需的擴(kuò)增代次太多。目前國(guó)內(nèi)普遍采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)，將原代細(xì)胞分離后直接上轉(zhuǎn)瓶，因此凍存細(xì)胞每個(gè)凍存單位的細(xì)胞量必須達(dá)到一個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)所需的細(xì)胞量。本試驗(yàn)證明，用常規(guī)接種一個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)所需的細(xì)胞總量?jī)龃嬖谝粋€(gè)凍存容量（200mL凍存袋）中，解凍后細(xì)胞存活率、貼壁率、生長(zhǎng)行為無顯著變化［6-8］，這就實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞凍存與工廠化培養(yǎng)的直接對(duì)接。

本項(xiàng)試驗(yàn)中，牛睪丸細(xì)胞最長(zhǎng)凍存期限僅為360d，其極限凍存時(shí)限有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞凍存溫度為-80℃，而不是常規(guī)的液氮凍存，這是因?yàn)椋核玫募?xì)胞凍存袋為聚乙烯類塑料，該材質(zhì)在低溫下易于老化，在液氮溫度下，該材質(zhì)還容易炸裂，因此在細(xì)胞凍存的包裝材料上尚需進(jìn)一步研究。

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