系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織γδT細(xì)胞TGF-β1表達(dá)研究

程 軍 張 雯 程擎天 羊淑敏 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院腎內(nèi)科 杭州 310003

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)除皮疹外，尚有腎、肝、心等器官損害，且常伴有發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛等全身癥狀。腎臟是SLE重要的損傷的靶器官之一，從病理檢查發(fā)現(xiàn)90%以上的SLE患者中有腎臟受損。狼瘡性腎炎導(dǎo)致終末期腎功能衰竭是SLE患者致死的重要原因之一。因此進(jìn)一步深入研究SLE及其狼瘡性腎炎的免疫發(fā)病機(jī)制很有必要。近年研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性疾病與γδT細(xì)胞密切相關(guān)[1]。作為SLE重要損傷部位的的腎臟，γδT細(xì)胞在狼瘡性腎炎中發(fā)病地位目前尚不清楚。本研究觀察了γδT細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠外周血、腎組織的分布情況，并檢測(cè)了γδT細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 模型組小鼠15只，12周齡，雌性，體質(zhì)量30～37 g，MRL/Lpr系自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠（SPF級(jí)），購自中國科學(xué)院上海藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。正常對(duì)照組小鼠10只，BALB/C，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，均為雌性，10周齡，體質(zhì)量19～21 g。均在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)適應(yīng)1周，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，室溫24℃，自然晝夜循環(huán)，非直接光照條件下生活，小鼠進(jìn)食飲水自由。

1.2 藥物與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液、抗核抗體試劑，抗小鼠TCRγδ單克隆抗體、抗小鼠TCRγδ-FITC（上海晶美公司）、重組小鼠IL-2細(xì)胞因子（邦定生物醫(yī)學(xué)公司）、小鼠TGF-β1 ELISA試劑盒、24孔培養(yǎng)板、胎牛血清（杭州四季青生物公司）；尿蛋白試紙為廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡為日本 Olympas產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀（FACSCa li bur）為美國 BECTON DICKINSON產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 抗核抗體檢測(cè) 采用間接免疫熒光法，按試劑盒說明操作。熒光二抗為FI TC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.2 尿蛋白檢測(cè) 用尿蛋白試紙蘸取小鼠尿液，與標(biāo)準(zhǔn)尿液分析試紙條的顏色，并進(jìn)行比較，結(jié)果以-、+、++、+++表示。

2.3 尿蛋白定量檢測(cè) 通過考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)小鼠24h尿蛋白定量，免疫熒光法檢測(cè)腎組織IgA的沉積情況。于實(shí)驗(yàn)第10周末，注射完SEB后，用代謝籠收集小鼠24 h尿液，記錄尿量，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定尿蛋白濃度，計(jì)算24 h尿蛋白排泄量（具體方法參照試劑說明書進(jìn)行）。

2.4 SLE小鼠外周血、腎組織、脾臟γδT細(xì)胞比率測(cè)定

2.4.1 腎皮質(zhì)中淋巴細(xì)胞制備 取一小塊腎皮質(zhì)，通過直徑250 μm濾網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，并用PBS沖洗收集濾過細(xì)胞，再以1 500 r/min離心10 min，收集的細(xì)胞重新懸浮在含40%Percoll的1640液中，然后取上述細(xì)胞懸液緩慢覆蓋在含66.7%的Percoll溶液上，以2 100 r/min室溫條件下離心20 min。分離細(xì)胞以PBS液反復(fù)洗滌，備用。

2.4.2 脾臟中淋巴細(xì)胞的制備 取一小塊脾臟組織，通過直徑250 μm濾網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，并用PBS沖洗收集濾過細(xì)胞，用生理鹽水對(duì)倍稀釋后加入Ficoll上，以2 200 r/min離心30 min分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），再依次以 1 500 r/min、1 000 r/min、800 r/min離心10 min洗滌，計(jì)數(shù)后備用。

2.4.3 外周血PBMC的制備 無菌抽取小鼠靜脈血3 mL置于肝素抗凝管中，用生理鹽水對(duì)倍稀釋后加入Ficoll上，以2 200 r/min離心30 min分離PBMC，再依次以 1 500 r/min、1 000 r/min、800 r/min 離心10 min洗滌，計(jì)數(shù)后備用。

2.4.4 腎臟、外周血、脾臟中γδT細(xì)胞比率檢測(cè) 取含1×105個(gè)分離的淋巴細(xì)胞懸液，以含10 g/L BSA的PBS液重懸后，加入抗小鼠TCRγδmAb-FITC，室溫靜置30 min。用10 g/L多聚甲醛固定后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞的陽性率。陰性對(duì)照為FITC標(biāo)記的正常IgG類型。

2.5 腎組織、脾臟中γδT細(xì)胞的擴(kuò)增及鑒定 按照我們已經(jīng)建立的方法[2]，將含1 mg/L抗 TCRγδmAb的無血清RPMI1640培養(yǎng)液加入到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃包被2 h。洗板后，加入1×106/mL個(gè)前述方法獲得的淋巴細(xì)胞，再加入含10%的胎牛血清和200U/mL rIL-2的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2～4天反復(fù)吹打培養(yǎng)液，并吸取總數(shù)為2×106個(gè)細(xì)胞分孔擴(kuò)大培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況加入含血清和200U/mL rIL-2的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后即可建立培養(yǎng)體系，每7天、14天取培養(yǎng)細(xì)胞以流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞的比率，方法同前。

2.6 TGF-β1檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)體系的建立:分別將脾臟、腎組織γδT細(xì)胞按1×106個(gè)γδT細(xì)胞/孔加入RPMI1640培養(yǎng)基24孔培養(yǎng)板中，分別加入抗小鼠CD3 mAb（終濃度1μg/L），每孔液量1 mL。5%CO2、37℃條件下培養(yǎng) 48 h。1 000 r/m 離心，收獲孔內(nèi)上清，分裝留測(cè)細(xì)胞因子TGF-β1，方法為ELISA，按照說明書操作。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抗核抗體檢測(cè) SLE模型組抗核抗體滴度為1：320～1：1 000；正常對(duì)照組全部為陰性。

3.2 小鼠尿蛋白檢測(cè) 模型組中6只+，9只++。正常對(duì)照組尿蛋白均為陰性。

3.3 24 h尿蛋白定量測(cè)定 模型組高于正常對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠24h尿蛋白定量比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05

24h尿蛋白定量/mg 0.62±0.46 7.05±1.72△組 別正常對(duì)照組SLE模型組n/只10 15

3.4 外周血γδT細(xì)胞比率 模型小鼠外周血γδT細(xì)胞比率明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠外周血γδT細(xì)胞比率比較（±s）

表2 兩組小鼠外周血γδT細(xì)胞比率比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05

γδT細(xì)胞/%4.65±2.35 19.88±7.47△組 別正常對(duì)照組SLE模型組n/只10 15

3.5 SLE小鼠腎組織、脾臟γδT細(xì)胞比率 正常小鼠腎組織未發(fā)現(xiàn)有γδT細(xì)胞浸潤，SLE小鼠腎組織有γδT細(xì)胞的浸潤；正常組及SLE模型組小鼠脾臟中可檢測(cè)到γδT細(xì)胞，但明顯低于腎組織（P＜0.05），見表3。

表3 兩組小鼠腎組織和脾臟γδT細(xì)胞比率比較（±s）

表3 兩組小鼠腎組織和脾臟γδT細(xì)胞比率比較（±s）

注：與模型組腎組織比較，△P＜0.05

γδT 細(xì)胞/%1.65±0.67△1.92±0.64△11.69±5.47組 別正常組脾臟SLE模型組脾臟SLE模型組腎組織n/只10 15 15

3.6 小鼠腎組織與脾臟組織γδT細(xì)胞分泌TGF-β1水平 SLE模型小鼠腎組織γδT細(xì)胞分泌TGF－β1水平明顯高于正常組和SLE模型組脾臟中γδT細(xì)胞（P＜0.05），見表4。

表4 兩組小鼠TGF－β1水平比較（±s） pg/mL

表4 兩組小鼠TGF－β1水平比較（±s） pg/mL

注：與模型組腎組織比較，△P＜0.05

TGF－β1 41.50±19.43△47.30±25.15△112.80±34.19組 別正常組小鼠脾臟SLE模型組脾臟SLE模型組腎組織n/只10 15 15

3.7 相關(guān)性分析 SLE小鼠腎組織中γδT細(xì)胞分泌TGF－β1水平與蛋白尿水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.34，P＜0.05）。

4 討論

SLE是一種常見多因性自身免疫病,病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。其中MRL/Lpr小鼠是常用的SLE動(dòng)物模型之一[3]，其癥狀與人類SLE相似,包括顯著的血清自身抗體、免疫復(fù)合物腎小球腎炎，血管炎等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道一致，MRL/Lpr小鼠出現(xiàn)蛋白尿，抗核抗體滴度達(dá)到 1：320～1：1 000，腎臟損傷出現(xiàn)蛋白尿,表明實(shí)驗(yàn)所用的MRL/lpr小鼠全部處于發(fā)病狀態(tài)。

SLE的發(fā)病與T細(xì)胞的病變密切相關(guān)，調(diào)控產(chǎn)生自身抗體的自身反應(yīng)性T細(xì)胞有αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞，目前研究主要集中在αβT細(xì)胞，對(duì)于γδT細(xì)胞研究較少。研究顯示，γδT細(xì)胞在SLE的發(fā)病中起著重要作用。Peng[4]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏γδT細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的SLE病變及腎臟損害，并認(rèn)為γδT細(xì)胞具有部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫功能，可以調(diào)節(jié)αβT細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體功能，從而對(duì)SLE具有保護(hù)作用。Fujii等[5]研究發(fā)現(xiàn)，體外γδT能抑制TB細(xì)胞協(xié)同產(chǎn)生抗體。Robak等[6]研究發(fā)現(xiàn)，雖然SLE患者外周血γδT細(xì)胞下降，但SLE患者的皮膚可見γδT明顯增高，其可變區(qū)基因重排表現(xiàn)為限制性取用，其中Vdelta2 TCR+與Vgamma9 TCR+顯著增高，并與SLE患者活動(dòng)性密切正相關(guān)性。

調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory tcells，tregs）是 T 細(xì)胞的一個(gè)亞群，能通過影響其它免疫細(xì)胞的活性來發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的功能。近年來，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成為免疫學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。經(jīng)典的CD4+CD25+的功能已經(jīng)基本明了，CD4+CD25-T細(xì)胞在體外經(jīng)過TGF-β1的誘導(dǎo)可以轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+Treg，并且高表達(dá)Treg的特異性標(biāo)記物FoxP3[7]。γδT細(xì)胞雖然只占總T細(xì)胞的一小部分，但其獨(dú)特的抗原識(shí)別模式使得γδT細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。近年研究表明，γδT細(xì)胞無論在病理以及生理狀態(tài)下均具有免疫調(diào)節(jié)功能。研究顯示，γδT細(xì)胞能高表達(dá)細(xì)胞因子TGF-β1調(diào)節(jié)免疫，而不是表達(dá)TH1細(xì)胞的炎性因子IFN-γ[8-9]。

本研究表明，狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織中存在γδT的浸潤，并發(fā)現(xiàn)腎組織中γδT存在TGF-β1的高表達(dá)，高表達(dá)的TGF-β1與尿蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。因此，我們推測(cè)狼瘡性腎炎小鼠腎組織炎癥導(dǎo)致了某種特異抗原分子的釋放，激活并誘導(dǎo)了γδT細(xì)胞在腎臟中參與固有免疫活動(dòng)，γδT細(xì)胞在腎臟同樣以限制性亞群表達(dá)?；罨摩忙腡細(xì)胞同樣具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能，對(duì)SLE腎組織表現(xiàn)為保護(hù)性作用。

[1]Rochman Y，Spolski R，Leonard WJ.New insights into the regulation of T cells by gamma（c） family cytokines Nat Rev Immunol[J].Review，2009，9（7）:480-490.

[2]程軍，呂國才，張雯，等.IgA腎病患者外周血γδT細(xì)胞表達(dá)TGF-β1功能的研究[J].中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志，2006，26（3）:267-268.

[3]張飚，唐福林.系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠 MRL/lpr研究進(jìn)展[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，2（10）:110-113.

[4]Peng SL，Madaio MP，Hayday AC，et al.J.Propagation and regulationof systemicautoimmunity by gammadeltaT cells[J].J Immunol，1996，157（12）:5689-5698.

[5]Fujii T，Okada M，Craft J.Regulation of T cell-dependent autoantibody production by a gammadelta T cell line derived from lupus-prone mice[J].Cell Immunol，2002，217（1-2）:23-35.

[6]Robak E，Niewiadomska H，Robak T.Lymphocyctes Tgammadelta in clinically normal skin and peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus and their correlation with disease activity[J].Mediators Inflamm，2001，10（4）:179-189.

[7]Fan H，Wang J，Zhou X，et al.Induction of antigen-spe cific immune tolerance by TGF-beta-induced CD4+Foxp3+regulatory T cells [J].Int J Clin Exp Med，2009，2（3）:212-220.

[8]Kühl AA，Pawlowski NN，Grollich K.Human peripheral gammadelta T cells possess regulatory potential[J].Immunology，2009，128（4）:580-588.

[9]Park SG，Mathur R，Long M.T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing γδT cells[J].Immunity，2010，24;33（5）:791-803.