HPLC 法測(cè)定伏立康唑乳劑的含量及其有關(guān)物質(zhì)

張新事，付淑軍，林小燕，李玉娟（1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081；.國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院/瀚盟生物技術(shù)（天津）有限公司，天津 300457）

伏立康唑（Voriconazole）為美國(guó)輝瑞公司開(kāi)發(fā)的第2代三唑類(lèi)抗真菌藥物，2002年8月在美國(guó)首次上市。伏立康唑口服和靜脈給藥均有很好的抗真菌活性，對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌均有強(qiáng)抑菌作用，是治療深部真菌感染首選藥[1～4]。目前臨床上主要使用的是伏立康唑靜脈輸注用凍干粉末。由于伏立康唑水溶性很差，因此該制劑中加入了大量硫代丁基醚-β-環(huán)糊精進(jìn)行增溶，但也導(dǎo)致可能存在給藥時(shí)刺激性強(qiáng)、易發(fā)生溶血等不良反應(yīng)[5]。北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室采用獨(dú)特的乳化技術(shù)，利用伏立康唑可在油水兩相中形成非均勻的水包油型液體分散體系的特點(diǎn)，將其制成靜脈注射用乳劑。由于不含大量的增溶劑，可減少由此而導(dǎo)致的溶血等不良反應(yīng)，還可降低給藥時(shí)產(chǎn)生的刺激性，減少藥物的毒副作用。

鑒于伏立康唑乳劑基質(zhì)的復(fù)雜性，干擾成分多，因此有必要建立靈敏、專(zhuān)屬的方法進(jìn)行主藥及其有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定。本文采用高效液相色譜（HPLC）法，建立了伏立康唑乳劑的含量測(cè)定方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于伏立康唑乳劑的含量測(cè)定及其有關(guān)物質(zhì)的控制。

1 儀器與試藥

HPLC系統(tǒng)，包括LC-10AT輸液泵、SPD-10A紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；N-2000色譜工作站（浙江大學(xué)）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純。

伏立康唑?qū)φ掌罚ㄈf(wàn)特制藥（海南）有限公司，批號(hào)：20100303，純度：99.9%）；伏立康唑乳劑（北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物分析實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：100701、100702、100703，規(guī)格：100 mg∶25 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-乙酸（40∶60∶0.25，V/V/V），流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm；靈敏度：0.01 AUFS；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按伏立康唑峰計(jì)應(yīng)不低于1 500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白基質(zhì)溶液：精密量取本品的空白基質(zhì)0.1 mL（按照乳劑處方所用賦形劑的種類(lèi)和用量制備，但不含伏立康唑），置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇5 mL后振搖，再以無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)定減壓干燥至恒重的伏立康唑?qū)φ掌?.00 mg，加無(wú)水乙醇溶解并逐級(jí)稀釋成濃度為100.0、50.0、20.0、10.0、5.00、2.00、1.00 μg·mL－1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液：精密量取本品0.1 mL（相當(dāng)于伏立康唑0.4 mg），置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇5 mL后振搖，再以無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 樣品破壞溶液：精密量取本品0.1 mL（相當(dāng)于伏立康唑0.4 mg）5份，各置于25 mL容量瓶中，其中3份分別加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉、0.1 mol·L－1鹽酸、3%雙氧水各0.2 mL，室溫放置2 h，加無(wú)水乙醇5 mL后振搖，再以無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得堿、酸和氧化破壞后樣品溶液；另2份置于25 mL容量瓶中，分別于4 500 lx條件室溫下放置5 d及（40±5）℃下放置5 d，加無(wú)水乙醇5 mL后振搖，再以無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得光照破壞溶液和高溫破壞樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取空白溶劑（無(wú)水乙醇）、空白基質(zhì)、對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)樣分析，色譜見(jiàn)圖1；各破壞后樣品溶液色譜見(jiàn)圖2。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.空白基質(zhì)；C.對(duì)照品；D.供試品；Ⅰ、Ⅱ.來(lái)自賦形劑的干擾峰；Ⅲ.伏立康唑；Ⅳ.可能的降解產(chǎn)物Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.blank matrix；C.substance control；D.test sample；Ⅰ，Ⅱ：interfering peaks from excipients；Ⅲ：voriconazole；Ⅳ：potential degradation product

圖2 破壞樣品溶液的高效液相色譜圖A.酸破壞樣品溶液；B.堿破壞樣品溶液；C.光照破壞樣品溶液；D.高溫破壞樣品溶液；E.氧化破壞樣品溶液；Ⅰ、Ⅱ.來(lái)自賦形劑的干擾峰；Ⅲ.伏立康唑；Ⅳ.可能的降解產(chǎn)物Fig 2 HPLC chromatograms of destroyed sample solution A.solution destroyed by acid；B.solution destroyed by alkal；C.solution destroyed by light；D.solution destroyed by heat；E.solution destroyed by oxidation；Ⅰ，Ⅱ.interfering peaks from excipients；Ⅲ.voriconazole；Ⅳ.potential degradation product

由圖1可見(jiàn)，在空白溶劑的色譜圖（圖1A）中未發(fā)現(xiàn)有干擾峰的存在；而在空白基質(zhì)的色譜圖（圖1B）中含有2個(gè)雜質(zhì)峰，其保留時(shí)間分別為5.2、6.0、12.4 min（注：3個(gè)化合物尚未鑒定）；在對(duì)照品的色譜圖（圖1C）中，伏立康唑的保留時(shí)間為15.9 min。表明溶劑及乳劑中的賦形劑均不干擾伏立康唑的測(cè)定。

由圖2可見(jiàn)，伏立康唑?qū)φ掌啡芤航?jīng)堿破壞后出現(xiàn)保留時(shí)間為6.7 min的色譜峰，另外本品在酸、氧化、光照及高溫條件下均出現(xiàn)保留時(shí)間為6.7 min的色譜峰，尤其在堿、氧化和高溫破壞樣品中含量較高，因此可確定其為伏立康唑乳劑中的有關(guān)物質(zhì)。比較上述色譜圖可知，乳劑中賦形劑、降解產(chǎn)物、伏立康唑以及溶劑色譜峰彼此之間均分離良好。因此本方法對(duì)伏立康唑乳劑中伏立康唑的測(cè)定具有良好的專(zhuān)屬性。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)定減壓干燥至恒重的伏立康唑?qū)φ掌?.00 mg，加無(wú)水乙醇溶解并逐級(jí)稀釋成濃度為100.0、50.0、20.0、10.0、5.00、2.00、1.00 μg·mL－1的溶液，各取20 μL，依次注入液相色譜儀，記錄色譜。以伏立康唑的色譜峰面積（y）對(duì)濃度（x）回歸，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程為y＝2×106x+5 735.5（r＝0.999 9），結(jié)果表明伏立康唑檢測(cè)濃度線(xiàn)性范圍為1.00～100.0 μg·mL－1。

2.5 檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)

稱(chēng)取伏立康唑?qū)φ掌愤m量，以無(wú)水乙醇溶解并稀釋到一定濃度，吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。分別以伏立康唑色譜峰響應(yīng)值約為基線(xiàn)噪音的3倍（信噪比為3）和10倍（信噪比為10）時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果，檢測(cè)限為0.3 ng·mL－1，定量限為1.0 ng·mL－1。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，制得后即放置在室溫條件下，分別于第0、2、5、10、25 h取樣20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，計(jì)算其RSD＝0.71%。表明供試品溶液室溫放置25 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品，制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果RSD＝0.33%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 中間精密度試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品，由2名分析者，分別在2 d內(nèi)在2臺(tái)不同的色譜儀上進(jìn)行含量測(cè)定，考察中間精密度，結(jié)果RSD＝1.80%，表明本方法中間精密度良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

平行量取已知含量的乳劑9份，每份0.10 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次加入低、中、高3種濃度的對(duì)照品溶液5.0 mL，制備供試品溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，低、中、高3個(gè)濃度的平均加樣回收率為98.8%，RSD＜2%，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度，詳見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery test

2.10 樣品中主藥含量測(cè)定

精密量取本品0.10 mL（相當(dāng)于伏立康唑400 μg），置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇5.0 mL，振搖，繼續(xù)以無(wú)水乙醇稀釋到刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。取上述供試品溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果，3批伏立康唑乳劑的含量測(cè)定結(jié)果均符合規(guī)定，詳見(jiàn)表2。

表2 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of 3 batches of samples

2.11 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

量取本品1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇5.0 mL，振搖，以無(wú)水乙醇稀釋到刻度，搖勻；以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得約含160 μg·mL－1伏立康唑的供試品溶液。另精密量取適量對(duì)照品貯備液，以無(wú)水乙醇稀釋制成約含1.6 μg·mL－1伏立康唑的對(duì)照溶液。照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，量取對(duì)照溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿(mǎn)量程的10%～20%；精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)的峰面積之和不得大于對(duì)照液中主成分峰面積的3倍（3.0%）。經(jīng)檢測(cè)，3批伏立康唑乳劑的有關(guān)物質(zhì)含量分別為1.13%、1.03%和1.02%。

3 討論

在前期試驗(yàn)中，筆者分別考察了2種比例流動(dòng)相系統(tǒng)乙腈-水-乙酸（55∶45∶0.25，40∶60∶0.25，V/V/V）對(duì)分析的影響。當(dāng)以前者為流動(dòng)相時(shí)，伏立康唑的保留時(shí)間為7.0 min，分析時(shí)間適中。但在進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)的影響因素試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)分離度較差，峰形不對(duì)稱(chēng)，因此繼續(xù)對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定后者為流動(dòng)相。在此條件下，伏立康唑與雜質(zhì)能夠完全分開(kāi)，峰形對(duì)稱(chēng)，伏立康唑的保留時(shí)間為15.9 min。在上述色譜條件下，主要存在3個(gè)可能的雜質(zhì)峰，其與伏立康唑以及彼此之間的分離度均大于1.5，符合有關(guān)要求。

在伏立康唑乳劑中，伏立康唑被包合于水包油的乳粒中，若要對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，首先應(yīng)采用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑實(shí)施破乳，釋放伏立康唑。本試驗(yàn)考察了用于破乳的多種有機(jī)溶劑，包括甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇的破乳效果最好，并且適用于隨后的HPLC分析。

伏立康唑乳劑中含有精制蛋黃磷脂、油酸、注射用大豆油、甘油、維生素E等賦形劑，基質(zhì)組成相對(duì)復(fù)雜，可能給含量及其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定帶來(lái)干擾。文獻(xiàn)[4]報(bào)道方法均為原料藥或注射劑的分析檢測(cè)方法，與乳劑相比，其基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，干擾較少；而本實(shí)驗(yàn)室制備的乳劑基質(zhì)復(fù)雜，采用文獻(xiàn)報(bào)道方法干擾多，不適用于本研究。因此，本試驗(yàn)成功建立了用于伏立康唑乳劑的主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定的HPLC法，經(jīng)方法驗(yàn)證，確認(rèn)本方法準(zhǔn)確可靠、專(zhuān)屬性強(qiáng)，適用于伏立康唑乳劑的快速分析。

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