RP-HPLC 法測(cè)定卡鉑制劑中卡鉑的含量

張 萍，楊 慧，宋 梅，曹 丹（江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，江蘇徐州 221116）

卡鉑（Carboplatin，CBP）化學(xué)名為順-二氨-1，1-環(huán)丁烷二羧酸合鉑，屬第2代鉑類廣譜抗癌藥[1]，其抗瘤譜、療效和骨髓毒性均與順鉑相似，而胃腸道和腎毒較順鉑輕，臨床廣泛用于多種惡性腫瘤的治療。2000年版[2]、2005年版[3]、2010年版[4]《中國(guó)藥典》中以高效液相色譜（HPLC）法作為藥物卡鉑的含量測(cè)定方法，在該方法中均以水為流動(dòng)相，這一點(diǎn)值得商榷。因?yàn)楫?dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生疏水坍塌現(xiàn)象，此現(xiàn)象是由流動(dòng)相不浸潤(rùn)固定相表面所致。同時(shí)，卡鉑的極性較強(qiáng)，極易與色譜柱未鍵合的硅羥基鍵合，從而導(dǎo)致峰的對(duì)稱性達(dá)不到藥典的要求，實(shí)際操作中其對(duì)稱性大大偏離藥典的規(guī)定，見(jiàn)圖1。為此，筆者對(duì)卡鉑含量的測(cè)定條件進(jìn)行了研究，解決了上述問(wèn)題。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型HPLC儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；CP 6201型萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

卡鉑對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：10322-0101，純度：99.99%）；卡鉑注射液（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：9110102ES、9080082ES、9110204ES，規(guī)格：10 mL：100 mg/支）；注射用卡鉑（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：9060081DA、9060082DA、9060083DA，規(guī)格：0.1g/支）；甲醇為色譜純（美國(guó)Merk公司，規(guī)格：4 L）；辛基磺酸鈉為色譜級(jí)試劑（Regal-Biotechnology Company、25 g）；水為超純水（石英亞沸蒸餾并用美國(guó)Millipore公司Milli-Q 50型超純水儀處理）；其他試劑均為分析純。

圖1 高效液相色譜圖A.以往色譜條件下卡鉑峰；B.新色譜條件下的卡鉑峰Fig 1 HPLC chromatogramsA.chromatographic peak in previous method；B.chromatographic peak in new method

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（含2.5 mmol·L－1辛基磺酸鈉，V/V＝10∶90）；流速：1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：229 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取卡鉑對(duì)照品10.1 mg，置于10 mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液備用。

2.2.2 注射用卡鉑溶液的制備 取注射用卡鉑樣品（批號(hào)：9060081DA）約10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。進(jìn)樣前取適量過(guò)0.45 μm微孔濾膜。

2.2.3 卡鉑注射液的制備 精密吸取卡鉑注射液樣品（批號(hào)：9110102ES）1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。進(jìn)樣前，取適量過(guò)0.45 μm微孔濾膜。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 根據(jù)注射用卡鉑處方，取5.0 mg甘露醇置于100 mL容量瓶中，加超純水至刻度，即得注射用卡鉑陰性樣品溶液；根據(jù)卡鉑注射液處方取適量乙二胺四乙酸，注射用水溶解，稀釋即得卡鉑注射液陰性樣品溶液。

取標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液進(jìn)樣，結(jié)果卡鉑對(duì)照品中卡鉑的理論板數(shù)為7 384，對(duì)稱因子為0.96；注射用卡鉑及卡鉑注射液樣品中卡鉑的色譜峰與相鄰組分的色譜峰的分離度均＞1.5，理論板數(shù)分別為8 300、8 183，對(duì)稱因子分別為0.98、0.98。色譜見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.卡鉑對(duì)照品溶液；B.注射用卡鉑樣品溶液；C.卡鉑注射液溶液；D.注射用卡鉑陰性樣品溶液；E.卡鉑注射液陰性樣品溶液；1.卡鉑Fig 2 HPLC chromatogramsA.carboplatin solution control；B.Carboplatin for injection solution；C.Carboplatin injection solution；D.negative sample of Carboplatin for injection；E.negative sample of Carboplatin injection；1.carboplatin

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取已制備的1.01 mg·mL－1的卡鉑對(duì)照品貯備液適量，將其稀釋成濃度分別為0.505 0、0.252 5、0.101 0、0.050 5、0.025 25、0.010 1 mg·mL－1的卡鉑對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，每種濃度分別重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，以各對(duì)照品的檢測(cè)濃度（C，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得卡鉑回歸方程A＝7.018 1C+8.1957。結(jié)果表明，卡鉑檢測(cè)濃度在10.1～505.0 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 9）。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下濃度為0.101 mg·mL－1的卡鉑對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值。結(jié)果，卡鉑的峰面積RSD＝0.81%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下的供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件每隔6 h進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣9次，記錄峰面積積分值。結(jié)果，注射用卡鉑及卡鉑注射液樣品中卡鉑峰面積的RSD分別為0.89%、0.83%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密取同一批號(hào)注射用卡鉑（批號(hào)：9060081DA）及卡鉑注射液（批號(hào)：9110102ES）樣品適量，各6份。按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積和對(duì)稱因子。結(jié)果，注射用卡鉑及卡鉑注射液樣品中卡鉑峰面積的RSD分別為0.73%、0.80%，卡鉑對(duì)稱因子的RSD分別為0.96%、1.00%，表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的注射用卡鉑及卡鉑注射液供試品溶液適量，各9份，分別加入相當(dāng)于樣品中卡鉑含量80%、100%、120%的對(duì)照品（各3個(gè)），按供試品溶液制備和測(cè)定方法操作，以回歸方程計(jì)算供試品中卡鉑的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 注射用卡鉑的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests of Carboplatin for injection

表2 卡鉑注射液的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of recovery tests of Carboplatin injection

2.8 樣品含量測(cè)定

分別取3批注射用卡鉑和卡鉑注射液藥品，按照“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 注射用卡鉑和卡鉑注射液含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）Tab 3 Results of content determination of Carboplatin for injection and Carboplatin injection（n＝5）

3 討論

3.1 方法的創(chuàng)新性

按照2000年版[2]、2005年版[3]、2010年[4]版《中國(guó)藥典》中卡鉑的色譜條件，卡鉑峰的對(duì)稱性達(dá)不到藥典的要求；本文所提出的色譜條件能很好地解決這一問(wèn)題，并通過(guò)有機(jī)相的加入，延長(zhǎng)了色譜柱的使用時(shí)間。

3.2 溶劑的選擇

由于卡鉑溶劑水溶性好而脂溶性差，故本試驗(yàn)以水為溶劑，分離效果較好。

3.3 流動(dòng)相的選擇

卡鉑藥品成分單一，雜質(zhì)含量較少，在反相色譜條件下，出峰時(shí)間短，故等梯度洗脫應(yīng)該可以滿足需要。在水相流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑辛基磺酸鈉可以較好的改善峰形，以滿足藥典對(duì)峰對(duì)稱性的要求。在滿足對(duì)稱性和理論板數(shù)的同時(shí)適當(dāng)加入少量甲醇改善純水的流動(dòng)相環(huán)境，從而更有利于色譜柱的保養(yǎng)。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

很多文獻(xiàn)報(bào)道用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定卡鉑藥物制劑中卡鉑的含量[5～11]，但對(duì)于流動(dòng)相的選擇和對(duì)稱性的問(wèn)題并沒(méi)有過(guò)多關(guān)注。本研究所用HPLC儀配有二極管陣列檢測(cè)器，通過(guò)對(duì)卡鉑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全紫外波長(zhǎng)的掃描，確定了229 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，這也與報(bào)道一致[6]。本文采用RP-HPLC法在229 nm波長(zhǎng)處測(cè)定了卡鉑藥品中卡鉑的含量，結(jié)果表明該方法迅速、可靠、重復(fù)性好，能同時(shí)滿足含量測(cè)定中對(duì)流動(dòng)相、對(duì)稱性和理論板數(shù)的要求，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，具有較好的實(shí)用性且易于推廣應(yīng)用，適用于卡鉑制劑中卡鉑含量的測(cè)定。

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[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2000年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：136-137.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：108-109.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：134.

[5]李 杰，王景萍，周麗莉，等.卡鉑血藥濃度高效液相色譜分析[J].醫(yī)院論壇雜志，2004，20（25）：23.

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