HPLC 法測(cè)定肺結(jié)核患者血漿中利福噴丁的濃度

劉會(huì)民，張 潔，高金泉，吳 狄（天津市海河醫(yī)院，天津 300350）

利福噴丁為利福霉素類藥物的衍生物，其抗結(jié)核分枝桿菌活性比利福平強(qiáng)2～10倍[1]，利福噴丁的最低抑菌濃度（MIC）較利福平普遍低2～4倍[2]，如使利福噴丁血藥濃度保持較高水平，對(duì)于耐藥的結(jié)核患者應(yīng)用利福噴丁治療仍有一定療效[3]。目前利福噴丁臨床上經(jīng)常使用0.45 g，每周2次，為了解改變用藥方案后利福噴丁是否能達(dá)到藥物治療濃度，筆者建立以高效液相色譜法測(cè)定利福噴丁血藥濃度的方法，為臨床采用合理的給藥時(shí)間提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀，包括LC-10A泵、SPD-10A紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器（日本島津公司）；N-2000色譜工作站（浙江大學(xué)智能工程研究所）；KDC-16H型高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 試藥

利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)品（無(wú)錫山禾集團(tuán)第一制藥有限公司，含量：92.6%，批號(hào)：200507046）；內(nèi)標(biāo)：對(duì)硝基酚（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，含量：100%，批號(hào)20040706）；甲醇、色譜水為色譜純，冰乙酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（70∶30，用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH＝6）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：336 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 血漿樣品處理

用加液器準(zhǔn)確吸取40 μL含藥血漿于帶蓋塑料小試管內(nèi)，加入內(nèi)標(biāo)液200 μL，混勻，靜置5 min后，于高速離心機(jī)（10 000 r·min－1）離心5 min，取上清液于450 μm濾頭過(guò)濾后取20 μL進(jìn)樣分析。色譜圖詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C.血漿樣品；1.對(duì)硝基酚；2.利福噴丁Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+internal standard；C.plasma sample；1.d-nitrophenol；2.rifapentine

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿1 mL，加入適量利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制得含藥血漿，使其濃度分別為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、16.0、32.0 μg·mL－1。按“2.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，用峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）作縱坐標(biāo)，血漿樣品的濃度（X）作橫坐標(biāo)進(jìn)樣線性回歸，得利福噴丁回歸方程Y＝9.54X+1.5（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，利福噴丁血藥濃度在0.25～32.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 6），最低檢測(cè)限0.25 μg·mL－1。

2.4 精密度及回收率試驗(yàn)

將配制的利福噴丁濃度分別為0.5、4、16 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)血樣，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其日內(nèi)和日間RSD及回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（n＝5）

2.5 藥物干擾試驗(yàn)

本文選用了臨床常與利福噴丁合用的抗結(jié)核藥，如異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等藥物進(jìn)行觀察，除利福平在內(nèi)標(biāo)和利福噴丁之間出峰（并不影響利福噴丁的色譜峰）外，其他藥物也均未見(jiàn)干擾利福噴丁的色譜峰，說(shuō)明本法有較強(qiáng)專屬性。

2.6 臨床應(yīng)用

2.6.1 病例選?。哼x取26名應(yīng)用利福噴丁的肺結(jié)核患者，應(yīng)用劑量為450 mg，每周2次，分別在患者服藥后72、96 h時(shí)抽取患者血液1 mL，與肝素混合抗凝后，4 000 r·min－1離心10 min，分離血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，并計(jì)算結(jié)果。

2.6.2 藥物濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果：共監(jiān)測(cè)患者26例，其中男性∶女性＝22∶4；年齡在21～79歲之間，平均年齡52.88歲。在72 h時(shí)，23例有藥物濃度檢出，濃度范圍在0.07～6.83 μg·mL－1之間，96 h時(shí)的藥物濃度有15例未檢出，最高濃度2.55 μg·mL－1。根據(jù)藥物濃度，9例患者將藥物服法改為450 mg，q72h，3例患者停用利福噴丁，改用其他抗結(jié)核藥治療。

3 討論

本文所建立的利福噴丁血藥濃度的測(cè)定方法具有專屬性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。處理樣品采用甲醇沉淀蛋白后高速離心，取上清液直接進(jìn)樣，和液-液提取比較，藥物損失少，簡(jiǎn)化了處理方法。文獻(xiàn)報(bào)道[4]選用利福平為內(nèi)標(biāo)，但利福平易遇光分解，本文選用對(duì)硝基酚為內(nèi)標(biāo)，該物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于獲得，出峰快，與藥峰分離較好。采用甲醇-水作為流動(dòng)相價(jià)廉易得，對(duì)高效液相色譜儀流路部件損害小，因此，本方法具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

抗結(jié)核藥經(jīng)吸收入血后，在病灶部位需要達(dá)到一定的濃度才能起到抑制或殺滅結(jié)核桿菌的作用，藥物濃度低很可能誘發(fā)耐藥，濃度過(guò)高會(huì)增加藥物毒副作用[5]。本文26例肺結(jié)核患者中，通過(guò)監(jiān)測(cè)利福噴丁的血藥濃度，其中9例縮短了給藥時(shí)間，2例另改他藥治療。因此，利福噴丁在臨床應(yīng)用時(shí)，需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，才能保證藥物達(dá)到臨床合理用藥，減少耐藥性的發(fā)生。

[1]陳新謙，金有豫，湯 光.新編藥物學(xué)[M].第17版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：108.

[2]端木宏謹(jǐn)，劉宇紅，姜廣路，等.結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福噴丁與利福平交叉耐藥的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（3）：192.

[3]趙黎黎，馬海戰(zhàn)，曹文利，等.利福噴丁治療耐利福平肺結(jié)核80例臨床療效觀察[J].中國(guó)防癆雜志，2006，28（4）：244.

[4]黃必義，鄧立東.RP-HPLC法測(cè)定人血漿中利福噴丁的濃度[J].中國(guó)藥師，2005，8（2）：129.

[5]任麗娟，王 麗，羅小祥.治療藥物監(jiān)測(cè)在抗結(jié)核藥物治療中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2008，19（23）：1 827.