3種檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒的比較

錢 歡，唐 利

（1.上海交通大學 農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

豬繁殖與呼吸綜合征( PRRS) 是養(yǎng)豬業(yè)重要疾病之一。目前PRRS已經(jīng)遍及全球，而且危害嚴重，給世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展構(gòu)成了很大威脅。據(jù)估算，因PRRS造成的流產(chǎn)、死胎、弱仔等，每頭母豬損失約236美元，潛在損失高達502美元[1]。PRRS在我國呈現(xiàn)流行趨勢，特別是2006年以來，因變異株PRRS引起的高致病性豬藍耳病暴發(fā)后，我國幾乎很難找到一個PRRS的陰性場，PRRS給我國養(yǎng)豬業(yè)造成的損失是空前的。在PRRS抗體檢測方面， 國際上已經(jīng)有比較成熟的試劑盒，使用比較廣泛的主要是由IDEXX、INGEZIM和LSI等公司生產(chǎn)的PRRS抗體檢測試劑盒。但是這3種試劑盒結(jié)果判定標準不一樣，對臨床的指導意義也存在一些差異。為了更好地使用不同試劑盒用于PRRS檢測分析，我們比較了3種試劑盒的重復性、一致性以及其檢測結(jié)果與臨床發(fā)病之間的關系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑盒

Kit1：IDEXX公司生產(chǎn)的PRRS X3抗體檢測試劑盒；

Kit2：INGEZIM公司生產(chǎn)的PRRS UNIVERSAL（11.PRU.K.1/2）抗體檢測試劑盒；

Kit3：法國LSI公司生產(chǎn)PRRS抗體ELISA診斷試劑盒（PRRS-Ab）。

1.1.2 血清

比較試驗用的血清來自于四川某規(guī)?；i場，共計84份，其中母豬34份，仔豬48份，初乳2份，血清免疫背景、胎次及日齡明確。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑操作

按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 判定標準

按照其附帶說明書所述方法對結(jié)果進行判定。

Kit1：陰性對照平均值NCx=1/2（NC1 A650+ NC2 A650），陽性對照平均值PCx=1/2（NC1 A650+ NC2 A650），檢測樣本的計算S/P=（樣本A650- NCx）/（PCx- NCx），樣本的S/P值低于0.4，樣品應判定為PRRSV抗體陰性，樣本的S/P 值大于或等于0.4，樣品應判定為PRRSV抗體陽性；

Kit2：CUTT OFF值=0.15×PC A405，檢測樣本的計算S/P=樣本A405/PC A405，樣本A405小于CUTT OFF值，樣品應判定為PRRSV抗體陰性，樣本A405大于CUTT OFF值，樣品應判定為PRRSV抗體陽性，即：樣本的 S/P 值低于0.15，樣品應判定為PRRSV抗體陰性，樣本的S/P 值大于或等于0.15，樣品應判定為PRRSV抗體陽性；

Kit3：陰性對照平均值NCx=1/2（NC1 A450+ NC2 A450），陽性對照平均值PCx=1/2（NC1 A450+ NC2 A450），檢測樣本的計算IRPC = [(樣本A450 - NCx)/( PCx- NCx)] x 100，樣本的 IRPC 值小于等于20，樣品應判定為 PRRSV 抗體陰性，樣本的IRPC值大于20，樣品應判定為 PRRSV 抗體陽性，S/P=IRPC/100，即當樣本的S/P值小于等于0.20，樣品應判定為 PRRSV 抗體陰性，樣本的S/P值大于0.20，樣品應判定為PRRSV抗體陽性。

1.2.3 重復性試驗

從84份樣品中隨機抽取1份，將樣品設6個平行試驗孔，分別使用3種試劑盒做重復性試驗，操作方法嚴格按照操作說明書進行。

1.2.4 一致性分析

Kappa 統(tǒng)計量一致性強度按照文獻[7]的方法進行，Kappa 值愈高表示一致性愈好，當Kappa 值<0 時，表明兩方法間一致性為極差； 當Kappa 值在0.0～0.2范圍內(nèi)， 一致性為微弱；Kappa 值在0.21～0.40范圍內(nèi)，一致性為弱；Kappa 值在0.41～0.6 范圍內(nèi)；一致性為中度；Kappa 值在0.61～0.80 范圍內(nèi)；一致性為高度；Kappa 值在0.81～1.00 范圍內(nèi)，一致性為極強。

表1 重復性試驗結(jié)果

表2 Kit1 與Kit2試劑盒一致性分析

表3 Kit1 與Kit3試劑盒一致性分析

表4 Kit2 與Kit3試劑盒一致性分析

1.2.5 病毒血癥的檢測

隨機選取了25%的血清，抽提RNA，按照文獻[1]計一對引物，檢測PRRS病毒核酸。

2 結(jié)果

2.1 重復性試驗

重復性試驗結(jié)果從表1可以看出，同一份樣品，用3種不同試劑盒檢測，其陰性、陽性結(jié)果沒有變化。據(jù)標準差公式計算出3種試劑盒的S/P的標準差分別為：0.085、0.019、0.039。從6個重復樣品的標準差可知，3種試劑盒批內(nèi)差別不顯著，其中Kit2最小，試驗數(shù)據(jù)具有較高的參考價值。

2.2 一致性分析

用Kappa值對3種試劑盒的檢測結(jié)果兩兩之間進行一致性檢驗，Kit1與Kit2的Kappa值=0.762>0.6，表明Kit1與Kit2高度一致；Kit1與Kit3的Kappa值、Kit2與Kit3的Kappa值均為0.323>0.2，表明Kit1與Kit3、Kit2與Kit3一致性較弱 (表2、表3 和表4)。

2.3 病毒血癥的檢測

隨機選取的21份血清中，有7份為PRRSV核酸陽性（如圖1），其中PRRSV核酸陽性的血清中，3種試劑盒PRRS抗體陽性數(shù)分別為：Kit1為5份，Kit2為6份，Kit3為5份（見表5），顯示PRRSV可以與其抗體同時在血清中存在，也顯示3種試劑盒所檢測的PRRS抗體并非中和性抗體，當然PRRSV的感染與免疫機理還有待進一步研究。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征已經(jīng)成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病，如何有效防控成為學者關注的焦點。在實際生產(chǎn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)適宜的藍耳病疫苗免疫，在預防該病的暴發(fā)性發(fā)生和減輕臨床癥狀上具有一定作用。若能夠堅持長期、科學、規(guī)范的藍耳病免疫和抗體監(jiān)測，對大幅降低該病的發(fā)生幾率有很大幫助。目前，高致病性豬藍耳病活疫苗已經(jīng)納入國家強制免疫計劃，農(nóng)業(yè)部對活疫苗免疫合格的標準為，免疫28 d后，進行免疫效果監(jiān)測，高致病性豬藍耳病ELISA抗體IRPC值>20判為合格，存欄豬免疫抗體合格率≥70%判定為合格。但是生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，即使達到免疫合格，臨床發(fā)病的案例依然很多。

圖1 PRRS核酸檢測結(jié)果

表5 3種試劑盒檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果對比

豬只感染PRRSV野毒和接種活疫苗后，會產(chǎn)生一系列針對不同蛋白的抗體，但是目前沒有有效的檢測方法來區(qū)分野毒和疫苗毒產(chǎn)生的抗體。Yoon等[2]用間接免疫熒光試驗(IFA)、免疫過氧化物酶細胞單層試驗( IPMA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 和血清病毒中和試驗(SVN) 對實驗感染豬的體液免疫進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)感染后7～14 d就可檢出PRRSV 特異性循環(huán)抗體(IgM和IgG)，而中和抗體一般在感染后20～30 d才可檢出但持續(xù)時間較長。Loemba等[3]用Western Blotting方法分析證實，PRRSV 感染豬的免疫反應主要針對E蛋白、M蛋白、N蛋白。攻毒后7 d左右在感染豬體內(nèi)都能檢測出抗N抗體，而抗M蛋白、E蛋白的抗體則因個體而異，首次檢出時間為攻毒后9～28 d。

不同毒株間N蛋白保守性很高，因此N蛋白是ELISA包被抗原的最佳選擇。本研究使用的3種試劑盒中，Kit1和Kit2為N蛋白包被，故檢測的抗體為N蛋白抗體，該2種試劑盒用于感染壓力評估、感染預警、診斷以及免疫評估均有良好的指導意義，但這兩種試劑盒檢測的抗體水平與免疫保護之間沒有直接相關性。

PRRSV感染有一個很重要的特點是抗體依賴性增強作用（antibody dependent enhancement, ADE），即無論在體內(nèi)或體外的試驗條件下，PRRSV抗體的存在可介導和加強感染，而不是保護( K.J.Yoon 1996)。C.S.Choi 等(1992)報道,將PRRSV預先以抗PRRSV豬血清處理后再接種細胞，病毒在PAM中的感染可得以增強；而 W.T.Christianson 等(1993)發(fā)現(xiàn)用混有適量抗PRRSV血清的PRRSV感染子宮內(nèi)胚胎，其毒價比單用病毒感染的要高。這些報道表明PRRSV能不顧體液免疫應答而持續(xù)存活，本實驗也證實了這點。因此，通過血清抗體來評估PRRS疫苗的免疫效果不科學，但可以通過對PRRSV N蛋白抗體水平來監(jiān)測群體中PRRSV在活躍程度。

結(jié)合臨床實際情況和本實驗結(jié)果，我們認為Kit1、Kit2和Kit3在PRRS抗體檢測與評估方面均有各自的特點，其中Kit1和Kit2兩種試劑盒重復性相對較好，用于感染壓力評估和早期感染預警方面更有意義。

[1] 夏世邦，吳金華. Kappa 一致性檢驗在檢驗醫(yī)學研究中的應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29：83-84.

[2] Yoon K J, Zimmerman J J, Swenson S L，et al. Characterization of the humeral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) virus infection[J]. J.Vet.Diagn.Invest,1995（7）:305-312.

[3] Loemba H D, Mounir S, Mardassi H， et al. Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J] .Archive of Virology,1996,141:751-761.