豬血液的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析技術(shù)

劉建營(yíng)，曹長(zhǎng)仁，謝水華，樊福好

（農(nóng)業(yè)部種豬質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（廣州)，廣州 430070）

在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，人們已經(jīng)越來(lái)越不依賴(lài)于眼觀和僅僅憑借經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷豬病了。那種認(rèn)為“皮膚有出血點(diǎn)就是豬瘟”，“肝臟有壞死白點(diǎn)就是偽狂犬病”，“出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎就是弓形蟲(chóng)”，“出現(xiàn)腹瀉不是PED就是TGE”等等觀點(diǎn)早已被行業(yè)所拋棄。

血液學(xué)的檢測(cè)技術(shù)在當(dāng)前的養(yǎng)豬生產(chǎn)中已經(jīng)顯得越來(lái)越重要。為指導(dǎo)養(yǎng)豬生產(chǎn)提供更加科學(xué)的依據(jù)，為疫苗接種提供更加準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為飼養(yǎng)管理方式的采用和變更提供更加詳實(shí)的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的判定和數(shù)據(jù)分析技術(shù)越來(lái)越受到廣大科技工作者和養(yǎng)豬生產(chǎn)者的關(guān)注，本文擬對(duì)此進(jìn)行簡(jiǎn)述，以期拋磚引玉。

1 血液樣本的采集

豬的血液采集部位一般選擇在耳靜脈、頸靜脈和前腔靜脈進(jìn)行。耳靜脈采血雖然方便，但采血量不足；頸靜脈和前腔靜脈對(duì)采血的技術(shù)要求較高，一般難以掌握，但一旦掌握技巧，采血的速度將非常迅速，常在幾秒鐘內(nèi)即可完成。

過(guò)去采血一般使用注射器直接采集，但采集的血液容易受到污染，容易導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂和出現(xiàn)脂血的問(wèn)題，大大地影響檢測(cè)結(jié)果。

建議采用血液保護(hù)液（blood protesis?）進(jìn)行采血，具體步驟是:用注射器采集血液保護(hù)液約2 mL，然后采集血液約2 mL，輕度混勻。此時(shí)采集的血液上清為無(wú)色狀態(tài)而非淡黃色狀態(tài)，這些血液樣本大大利于進(jìn)行ELISA、PCR和血液生理生化的檢測(cè)。

在進(jìn)行血液檢測(cè)工作之前，首先要確定采集的樣本量。按照生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，應(yīng)該采用分層采樣（stratified sampling，又稱(chēng)分類(lèi)抽樣或類(lèi)型抽樣，先將總體樣本中全部個(gè)體按某種特征分成若干層，再?gòu)拿恳粚觾?nèi)隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體組成樣本）的方法。即首先確定一個(gè)類(lèi)別群體，比如公豬群、經(jīng)產(chǎn)母豬群、哺乳仔豬群、保育豬群、生長(zhǎng)豬群，等等。

通過(guò)抽樣確定總體樣本的屬性，要考慮檢測(cè)誤差、檢測(cè)結(jié)果的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差和置信區(qū)間來(lái)確定樣本量，如在豬瘟抗體檢測(cè)中，容許誤差為5，標(biāo)準(zhǔn)差為15，置信區(qū)間取95%，根據(jù)N=（1.96*標(biāo)準(zhǔn)差/誤差）2，則樣本量為35。即：容許誤差越小，估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差越大，置信區(qū)間越大，所需樣本量越大。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，按照現(xiàn)行市面上通用的檢測(cè)試劑盒的特異性和敏感性以及檢測(cè)結(jié)果的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，每個(gè)群體（即采樣層）需要采集樣本約30份左右為宜。采樣時(shí)，必須遵循隨機(jī)抽樣（random sampling）的原則。

2 抗體檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

在過(guò)去的曾經(jīng)一段時(shí)間內(nèi)，豬血液中的抗體（antibody）檢測(cè)一直采用間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination assay，IHA），但該方法操作繁雜，誤差較大，已經(jīng)被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所棄用（如豬瘟抗體的檢測(cè)）；而市面上的免疫金試驗(yàn)由于誤差較大，不能量化，結(jié)果不可信，推廣難度就顯得較大。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的檢測(cè)抗體的方式是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA），該方法操作規(guī)范，結(jié)果可靠，數(shù)據(jù)可通過(guò)計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)并便于分析。在進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，要注意的幾個(gè)事項(xiàng)是：孵育溫度要準(zhǔn)確、洗板力度要適宜、陰陽(yáng)性對(duì)照均需要分別設(shè)立至少2份以上（很多實(shí)驗(yàn)室采用一孔進(jìn)行陰性或陽(yáng)性對(duì)照來(lái)節(jié)省檢測(cè)成本的做法是不推薦的），采用保護(hù)液采集的血液樣本要換算稀釋倍數(shù)。

1)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)獲得的抗體結(jié)果分為3種：陽(yáng)性（positive）、陰性（negative）和可疑（suspect）（某些試劑盒未設(shè)置可疑結(jié)果）。由于這3種結(jié)果在本質(zhì)上是完全不同的，在分析結(jié)果時(shí)要分類(lèi)計(jì)算（classified counting），不可混合分析。比如：

陽(yáng)性率=陽(yáng)性結(jié)果數(shù)/檢測(cè)樣本總數(shù)。

平均值=陽(yáng)性結(jié)果總和/陽(yáng)性結(jié)果樣本總數(shù)（而非總樣本數(shù)）。

陰性結(jié)果無(wú)論數(shù)值大小，均應(yīng)歸至某一定值：如在豬瘟的抗體檢測(cè)中，阻斷率大于40為陽(yáng)性，30～40之間為可疑，30以下為陰性。假定3個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果分別為20、20、5，則這3個(gè)結(jié)果均應(yīng)歸為0，因?yàn)?0、20和5的意義和0是相同的，他們之間并不存在抗體含量在數(shù)值上的差異。即這3個(gè)樣本的抗體平均值為0，而不是15[原計(jì)算方法是：(20+20+5)/5=15]。

2)另外，為了實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室和不同檢測(cè)方法之間的比較，建議盡量采用相對(duì)抗體法（relative antibody titer）而不是絕對(duì)抗體法來(lái)標(biāo)示抗體的高低。表1中筆者采用了相對(duì)抗體法和歸零法標(biāo)示了20份樣本的豬瘟抗體水平。

表1 豬瘟抗體水平標(biāo)示

3)相對(duì)抗體的采用還具有另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是可以用來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的免疫效力。疫苗的免疫效力（immune efficacy index）的計(jì)算公式為：

免疫效力=抗體陽(yáng)性率與相對(duì)抗體平均值乘積的平方根

表2是筆者所在實(shí)驗(yàn)室計(jì)算所得2006-2012年各個(gè)年度的豬瘟抗體陽(yáng)性率，相對(duì)抗體平均值以及免疫效力（年檢測(cè)樣本量均在5萬(wàn)份以上，2012年僅取上半年數(shù)據(jù)）。

表2 2006－2012年的豬瘟抗體陽(yáng)性率、相對(duì)抗體平均值及免疫效力 /%

表3 某商品豬瘟疫苗的臨床應(yīng)用結(jié)果及效果評(píng)價(jià)

經(jīng)過(guò)計(jì)算得知（見(jiàn)表3），該疫苗接種豬群后，陽(yáng)性率為100%，相對(duì)抗體的平均值為94.4%，疫苗的免疫效力為97.2%，該疫苗是豬用疫苗市場(chǎng)中比較理想的豬瘟疫苗之一。

3 抗原檢測(cè)

抗原（antigen）的檢測(cè)方法與抗體檢測(cè)有所相似，但目前抗原檢測(cè)試劑盒大多數(shù)存在一定的不足之處，如可重復(fù)性差、存在較多的假陽(yáng)性（false positive rate）或假陰性（false negative rate）結(jié)果、樣品處理難度高，等等。

不過(guò)，用于檢測(cè)藥物殘留的試劑盒在質(zhì)量上已經(jīng)獲得了不小的進(jìn)展。

通過(guò)ELISA的方法甚至可以測(cè)試疫苗中的抗原含量，從而評(píng)定疫苗效果的優(yōu)劣。表4是筆者所在的實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的一項(xiàng)檢測(cè)。疫苗均來(lái)自于疫苗銷(xiāo)售的門(mén)店。

從表4中可以看出，品牌1的效果明顯優(yōu)于其他幾個(gè)品牌，品牌5雖然抗原量尚可，但其中的雜質(zhì)較多，低稀釋倍數(shù)影響了抗原的檢測(cè)；而品牌3、品牌6和品牌7則僅僅檢測(cè)出豬瘟疫苗抗原的可疑結(jié)果，未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

當(dāng)然，評(píng)價(jià)活疫苗抗原含量的方式還可以通過(guò)定量基因檢測(cè)來(lái)確定。

4 基因檢測(cè)

很多人把基因檢測(cè)（gene detection）混同于抗原檢測(cè)，這是一種理解上的誤差?；驒z測(cè)主要用于活的病原體的檢測(cè)，即檢測(cè)病原體的核酸（DNA和RNA）。核酸檢測(cè)的制約性因素主要是核酸的提取以及純化，若核酸降解或核酸被多糖以及蛋白質(zhì)污染，則很容易出現(xiàn)陰性結(jié)果。因此，各實(shí)驗(yàn)室必須在核酸的純化上多下功夫，不能單純依賴(lài)試劑盒。

表4 疫苗中的抗原含量檢測(cè)

核酸檢測(cè)的基本步驟包括：核酸釋放，核酸純化，核酸擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增的方法通常采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（簡(jiǎn)稱(chēng)PCR），根據(jù)核酸的性質(zhì)分為RT-PCR（用于檢測(cè)RNA）和PCR（用于檢測(cè)DNA）2種。

由于PCR反應(yīng)同時(shí)具備很高的敏感性，也極易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。因此，必須防止提純的核酸被實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他核酸的污染，盡量采用高度潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸的擴(kuò)增試驗(yàn)。

5 健康評(píng)價(jià)及數(shù)據(jù)分析

1）健康評(píng)價(jià)（health evaluation）是一項(xiàng)針對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)的量化評(píng)價(jià)技術(shù)，現(xiàn)已在中國(guó)各地陸續(xù)開(kāi)展，包括豬、牛、兔子、狗、貓、猴子等。健康評(píng)價(jià)的原理是通過(guò)檢測(cè)血液中的生理、生化指標(biāo)，并通過(guò)數(shù)學(xué)模型分析生理、生化指標(biāo)的相關(guān)性，導(dǎo)出機(jī)體的健康指數(shù)等一系列指標(biāo)來(lái)量化機(jī)體的健康狀態(tài)。健康評(píng)價(jià)是對(duì)抗原、抗體檢測(cè)以及基因檢測(cè)的一個(gè)良好補(bǔ)充，前者針對(duì)機(jī)體，后者針對(duì)病原體，體現(xiàn)了事物的2個(gè)方面。

營(yíng)養(yǎng)不良：機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足或供應(yīng)不平衡，均會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良或營(yíng)養(yǎng)失調(diào)（malnutrition）狀態(tài)。正常機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)不良指數(shù)為0，否則，營(yíng)養(yǎng)不良指數(shù)越高，機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)不良狀態(tài)越嚴(yán)重。營(yíng)養(yǎng)不良的典型臨床癥狀是機(jī)體皮膚蒼白、毛長(zhǎng)、消瘦。

中毒：中毒（toxic）是機(jī)體的一種狀態(tài)，可以通過(guò)中毒指數(shù)來(lái)衡量，正常機(jī)體為0。導(dǎo)致中毒的因素包括藥物中毒，金屬物中毒，霉菌毒素中毒和代謝性中毒。如機(jī)體肝臟和腎臟受損時(shí)，代謝物不易排出體外，則出現(xiàn)中毒狀態(tài)。中毒與臨床表現(xiàn)不具備相關(guān)性，甚至有些中毒的機(jī)體可以表現(xiàn)良好的生產(chǎn)性能。另外，機(jī)體發(fā)生中毒時(shí)，建議適當(dāng)補(bǔ)充維生素B12和葉酸，增強(qiáng)機(jī)體的排毒能力。

免疫抑制（immunosuppresion）：當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處在中毒狀態(tài)或受到病毒感染時(shí)，則出現(xiàn)免疫抑制。出現(xiàn)免疫抑制的機(jī)體對(duì)于疫苗接種反應(yīng)不良。

炎癥（inflammation）：正常機(jī)體的炎癥指數(shù)為0。炎癥的出現(xiàn)與機(jī)體的臨床表現(xiàn)有一定的相關(guān)性。機(jī)體長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致血液分布指數(shù)下降，影響豬群的生長(zhǎng)發(fā)育。嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)使豬體重不增反降，此所謂“炎多必失”。

血液分布（blood distribution）：血液分布與機(jī)體的抵抗力傳輸和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配具有直接的關(guān)系。正常機(jī)體的血液分布指數(shù)在80～100之間。血液分布指數(shù)過(guò)低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配不足，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)高度發(fā)育不良（即僵豬）。血液分布指數(shù)過(guò)高，則機(jī)體的抵抗力傳輸失衡，往往導(dǎo)致豬只死亡。

健康指數(shù)：健康指數(shù)（health index）是機(jī)體健康狀態(tài)的綜合指標(biāo)。100以上為健康狀態(tài)，70以下為病理狀態(tài)；70～100之間為亞健康狀態(tài)。

表5中的3頭豬均出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良狀態(tài)，原因是使用了質(zhì)量低下的豆粕造成，此時(shí)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)亦當(dāng)容易理解。

表6中，母豬出現(xiàn)中毒狀態(tài)，從而導(dǎo)致哺乳仔豬也出現(xiàn)中毒狀態(tài)；到了斷奶后，保育豬出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良狀態(tài)。所以，飼料的質(zhì)量事關(guān)養(yǎng)豬生產(chǎn)的成敗得失。

表5 3頭豬的健康評(píng)價(jià)

表6 健康評(píng)價(jià)案例

必須強(qiáng)調(diào)的是：懷孕母豬的中毒狀態(tài)對(duì)仔豬的影響很大，會(huì)導(dǎo)致仔豬的健康狀態(tài)不佳。若母豬奶水有毒素排出，則仔豬吮乳后會(huì)出現(xiàn)腹瀉。若仔豬在懷孕期間肝、腎受到損傷，則這些仔豬出生后會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育不良狀態(tài)，呼吸道問(wèn)題也會(huì)接二連三地發(fā)生。尤其強(qiáng)調(diào)的是，不僅僅是母豬奶水的數(shù)量，母豬奶水的質(zhì)量對(duì)仔豬影響更大，這一點(diǎn)必須重視。

2）豬群本身的健康問(wèn)題主要來(lái)源于2個(gè)方面：豬采食量不足或過(guò)多。采食量不足或采食量過(guò)度，機(jī)體均會(huì)出現(xiàn)一系列的臨床問(wèn)題，如皮膚蒼白或皮膚潮紅、毛孔出血、眼角下出現(xiàn)“淚斑”。對(duì)于發(fā)生的營(yíng)養(yǎng)不良問(wèn)題，可以通過(guò)增加采食量或平衡日糧來(lái)解決。采食和飲水功能的恰如其分（即不偏不倚）對(duì)于維持豬群的健康至關(guān)重要，此所謂“舌尖上的幸福”（happiness from a bite），豬群的“舌尖上的幸?！笔秋暳蠣I(yíng)養(yǎng)行業(yè)必須給予足夠研究和關(guān)注的內(nèi)容，也將成為涉及人類(lèi)食品安全的重要內(nèi)容。

在生產(chǎn)過(guò)程中，保持采食和排泄的平衡狀態(tài)，動(dòng)物可以維持健康狀態(tài)。

在日常的生產(chǎn)情況下，體內(nèi)產(chǎn)生的毒素和代謝產(chǎn)物主要通過(guò)機(jī)體增強(qiáng)血液分布能力，經(jīng)過(guò)尿液或糞便等途徑排出；而在病理的情況下，毒素則通過(guò)嘔吐、腹瀉、流產(chǎn)和乳汁等途徑排泄。

尿液和糞便對(duì)于機(jī)體的健康維持有著舉足輕重的作用，保持尿液和糞便排泄的暢通對(duì)于健康管理的順利實(shí)施有重要的理論意義和實(shí)踐意義。在營(yíng)養(yǎng)并不缺乏的環(huán)境條件下，尿道和肛門(mén)這兩個(gè)通道對(duì)于機(jī)體的“幸福生活”的作用非同凡響，此所謂“襠下的幸福”（happiness between legs）。

晉朝學(xué)者傅玄在他的一篇名為《口銘》的文中指出：“病從口入，禍從口出?！?/p>

何謂“口”，口即機(jī)體通向體外的孔竅。包括毛孔、口腔，鼻腔，眼睛，耳朵，尿道和肛門(mén)，尤其尿道和肛門(mén)在機(jī)體毒物排泄中起著重要的作用。尿液通過(guò)尿道，糞便通過(guò)肛門(mén)排泄機(jī)體的代謝產(chǎn)物，若此功能受到影響，將最終影響機(jī)體的正常生理機(jī)能。

所以，若尿液和糞便排泄正常，則機(jī)體機(jī)能才能維持一種理想的狀態(tài)，此即“襠下的幸?！?。那么，如何才能維持這種 “襠下的幸?！蹦?？參見(jiàn)①、②、③敘述。

①維持正常的腎臟功能。在當(dāng)前的養(yǎng)豬生產(chǎn)管理過(guò)程中，由于大量使用金屬類(lèi)添加劑和磺胺類(lèi)等藥物，肝臟的功能?chē)?yán)重受損，加之環(huán)狀病毒等病毒的感染，后果更加嚴(yán)重，機(jī)體通過(guò)尿液排泄毒物的功能大打折扣，甚至完全失去毒物的排泄能力，尿毒癥隨即發(fā)生。

降低飼料中的金屬類(lèi)、磺胺類(lèi)添加物對(duì)于維持腎臟功能有較大的作用。

另外，一些中草藥對(duì)腎臟功能同樣有影響，不能“迷信”中草藥的功效。如雷公藤、草烏、益母草、蓖麻子、麻黃、北豆根、巴豆、荊芥、牛膝、蘆薈和蒼耳子等會(huì)引起腎衰。近年報(bào)道，茴香桔梗丸、云南白藥、葛根素注射液、復(fù)方丹參注射液等中成藥也可引起急性腎衰。

②維持正常的肝臟功能。肝臟可以通過(guò)一系列的生化反應(yīng)來(lái)代謝進(jìn)入機(jī)體的物質(zhì)，但是，肝臟功能同樣會(huì)受到霉菌毒素等物質(zhì)的抑制，若肝臟受到病原體感染，則肝臟的解毒功能同樣也會(huì)下降。

另外，除了用于完成解毒功能以外，肝臟產(chǎn)生的一系列因子（血漿蛋白、凝血因子）可以用于維持機(jī)體的正常血液分布。若血液分布的平衡狀態(tài)改變，則容易出現(xiàn)胸水、腹水和心包積液等病癥，類(lèi)似于所謂“豬副嗜血桿菌感染”(Glasser’s diseases）的那種狀態(tài)。即：肝臟功能受損，血漿蛋白合成障礙，血液通透性增加，心包和胸腔積液增加，腹腔積液增加，白細(xì)胞滲出增加，自身免疫反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而發(fā)生心包炎、胸膜炎和腹膜炎，即所謂的“包心”、“包肺”和“包腸”。

③維持正常的肺臟功能。肺臟在機(jī)體的水分代謝中也起著非常重要的作用。若肺部感染嚴(yán)重，則機(jī)體通過(guò)肺部散發(fā)的水分過(guò)多，則腸道干燥，發(fā)生便秘，機(jī)體毒物蓄積嚴(yán)重。所以，保持肺部的清潔空氣流通，防止肺部感染同樣非常重要。因此，建造豬舍時(shí)，必須充分考慮通風(fēng)措施的落實(shí)，降低飼養(yǎng)密度，實(shí)施“適度分散、農(nóng)牧結(jié)合”（agriculture & scattering pig-raising）的飼養(yǎng)管理模式。所以，肺部的正常功能維持也與“襠下的幸?！毕⑾⑾嚓P(guān)。

6 總結(jié)

總之，豬血液的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是一項(xiàng)大的系統(tǒng)工程，不能追求那種一蹴而就的效果。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的對(duì)象包括病因和機(jī)體2個(gè)方面，二者缺一不可。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要遵循連續(xù)性原則，“平時(shí)不燒香，臨時(shí)抱佛腳”的思想是要不得的，不能等農(nóng)場(chǎng)（豬場(chǎng)）出了問(wèn)題才進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)則為時(shí)晚矣。

另外，中國(guó)的養(yǎng)豬企業(yè)要避免“大而全”的思想，一個(gè)存欄1000～2000頭左右母豬的農(nóng)場(chǎng)沒(méi)有必要建立一個(gè)“五臟俱全”的實(shí)驗(yàn)室，可以委托相關(guān)的科研機(jī)構(gòu)和院校，實(shí)現(xiàn)資源共享。而大型或超大型的養(yǎng)豬企業(yè)可考慮獨(dú)立建立實(shí)驗(yàn)室或聯(lián)合建立區(qū)域性實(shí)驗(yàn)室，方便采樣、檢測(cè)以及便于進(jìn)行商業(yè)性知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)工作。

（略）