豬水皰疹病診斷技術的研究進展

王 鳳，湯德元*，羅險峰，曾智勇，馬 萍，李春燕

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008）

豬水皰疹?。╒ES）是由豬水皰疹病毒（SESV）引起的豬的一種高度傳染性的急性疾病，其特征是在唇、齒齦、舌、腭、鼻鏡及四肢的蹄踵和趾間發(fā)生水皰性炎癥，臨床上很難與豬口蹄疫、豬水皰病和豬水皰性口炎相區(qū)別。本病最早(1932年)發(fā)現(xiàn)于美國加利福尼亞州，此后每年都有發(fā)生。1953年后蔓延至美國其他各州，42個以上的州經(jīng)常發(fā)生。隨后由于立法禁止以未煮熟的泔水喂豬，并對發(fā)病豬場采取屠殺對策，疫情明顯下降。最后一次暴發(fā)于1956年，美國官方于1959年宣布在全國范圍內(nèi)消滅了本病。1973年由海獅中分離到一株杯狀病毒，其特性與水皰疹病毒相同，稱為圣米吉爾海獅病毒(SMSV)，將該病毒接種給豬，可引起典型的水皰疹病變。人們認為，SMSV和SESV實際上是同一種病毒。至少從5種水生動物和2種陸生動物體內(nèi)檢出了SMSV抗體，說明SESV雖已從家養(yǎng)豬群中清除，但野生的陸生或水生動物中仍然可能存在。目前為止我國還未發(fā)現(xiàn)該病的流行，但隨著我國與其他各國貿(mào)易往來的加大，以及我國廣闊的海洋動物資源的開發(fā)利用，該病的潛在威脅應引起足夠的重視，因此，本文綜述了豬水皰疹病診斷技術的研究進展，以期為豬水皰疹病的預防奠定基礎。

近年來，隨著生物技術的迅速發(fā)展和儀器設備的不斷更新?lián)Q代，VES的檢測技術也得到了空前的發(fā)展。已經(jīng)建立了許多檢測方法，現(xiàn)將豬水皰疹病診斷技術的研究進展綜述如下：

1 豬水皰疹病的臨床診斷

豬感染本病毒12～48 h后，體溫升高(39.5～40.5 ℃)，持續(xù)高熱24～72 h，病豬精神不振，食欲下降，不愛活動，數(shù)天后在鼻鏡、唇、齒齦、舌、口腔、乳房、背部、腹部、蹄冠、蹄踵和趾間等部位出現(xiàn)紅點狀成硬塊的小水皰，初期水皰外觀蒼白、隆起，直徑5～30 mm，隆起高度約l0～20 mm。這種水皰類似燒燙傷或真皮過度摩擦所形成的水皰，泡內(nèi)充滿透明或灰白色漿液性液體，內(nèi)含有大量病毒，有的水皰可融合，2 d后水皰破潰，皮膚糜爛、潰瘍，形成褐色干痂。硬塊部位皮膚變薄，一搓即破，露出鮮紅嫩肉(組織)。隨后體溫下降，初期水皰破裂，暴露出夾雜有鮮紅、蒼白和黃色纖維性滲出或壞死的真皮糜爛面，漸漸干涸形成褐色干痂，通常 5～7 d內(nèi)愈合，干痂脫落，遺留輕微的疤痕，同時體溫恢復正常，疼痛、腫脹隨之減輕，動物趨于恢復。單純感染本病時，病豬可以迅速康復，無其他后遺癥。若有化膿性繼發(fā)感染時，病期可長達1～3個月， 嚴重時可造成病豬蹄殼脫落，且?guī)в絮诵邪Y狀，不能行走，起立困難，驅(qū)趕時嚎叫。新舊蹄殼替換后，可出現(xiàn)一條暗棕色或黑色的替換線，據(jù)此，可做出SVEV感染的初診。該病病程較短，一般病程為l周左右，口部病變愈合較快，但蹄部受環(huán)境影響可能繼發(fā)細菌感染而引起持續(xù)幾周的跛行。如果整個豬群都受到感染，有時可持續(xù)幾星期到幾個月。成年豬死亡率很低，但哺乳仔豬死亡率升高。據(jù)報道，乳豬的死亡是由于鼻孔中形成的水皰窒息所致，或者由于母豬不泌乳而餓死或并發(fā)嚴重的腹瀉。

2 豬水皰疹病的病理解剖診斷

發(fā)病初期，病豬皮膚和黏膜出現(xiàn)小面積變白并且隆起的水皰，隨著水皰的形成而擴散增大，水皰破裂部位發(fā)紅、潰瘍、糜爛。高出皮膚的水皰，充滿透明液體，皮下組織充血、水腫，有時出血。在四肢的蹄部趾間和蹄冠及在嘴筒的鼻鏡處出現(xiàn)黃豆般大的小瘤,其內(nèi)充滿一些較澄清的液體,水皰破裂后患處即呈輕度潰瘍。扁桃腺是最易受SVEV侵襲的器官，解剖可見扁桃腺呈暗紅色腫脹。同時可見胸腹部皮膚發(fā)紺，胸腹腔和心包積液，并含有少量纖維蛋白。心臟軟而蒼白，心肌可見明顯心肌炎，心肌充血、水腫，心肌纖維變性、壞死以及淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，灶性病變可見白堊中心，在右心室外膜最為多見，伸長到心肌的不同深度。壞死心肌有無機鹽沉著，形成鈣化。心膜層的滲出液中有嗜酸性細胞浸潤。肝臟和肺臟充血，輕度腫脹。脾褪色，輕度腦炎，可見點狀神經(jīng)元變性區(qū)，腦膜輕度充血。局部淋巴結(jié)充血、水腫，大量淋巴細胞變性、壞死。水皰液、水皰皮和淋巴結(jié)中含有大量的病毒，有時血液中也可檢測到少量病毒。

3 豬水皰疹病的的實驗室診斷

通過常規(guī)診斷方法可初步診斷本病，但要確診本病主要依靠實驗室診斷。常用的實驗室診斷方法有：病原學診斷、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、補體結(jié)合試驗、免疫熒光試驗等。

3.1 豬水皰疹病的病原學診斷

3.1.1 病料采集

水皰液、未破裂的水皰上皮或破裂的新鮮上皮是理想的病毒分離材料。無菌采取患豬水皰液或剛破潰的水皰皮，將水皰皮研磨，加入抗生素液，用PBS作5～10倍稀釋，4 ℃浸泡過夜，或置室溫4 h，離心除沉淀物，上清即為待檢病毒液。

3.1.2 病毒分離

取0.5 mL處理好的病毒懸液上清接種于豬源細胞或Vero猴腎細胞系單層細胞，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每間隔20 min輕輕振搖1 次，接種1 h后輕輕吸去接種液體后，加入5 mL細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)并逐日觀察是否出現(xiàn)細胞病變，SVEV導致的典型細胞病變（CPE）表現(xiàn)為細胞圓縮、溶解和細胞單層完全破壞。若5～7 d未出現(xiàn)細胞病變，盲傳至少3代方可判為陰性[1]。

3.1.3 電鏡觀察

一般來說，電鏡法可以有效地做出病原的診斷，可以通過電鏡來觀察病毒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征及立體構(gòu)型等特點。如將感染豬口腔黏膜細胞培養(yǎng)物制成超薄切片在電鏡下觀察，則可從平面上觀察到病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形態(tài)大小，復制方式等。采集病變部位材料做電鏡檢查，對區(qū)別豬水皰疹病與其他病毒引起的疾病是可行的。用采集的病料或培養(yǎng)物按常規(guī)方法初提純，在電鏡下觀察到嵌杯樣病毒典型粒子形態(tài)，作為病原學診斷的參考。

該法最為準確、可靠，但由于費時費力，需要昂貴的電鏡設備，限制其廣泛使用。

3.2 豬水皰疹病的血清學診斷

3.2.1 病毒中和試驗

病毒中和試驗(VNT) 只適用于檢查已知特異性病毒抗原或抗體，因為杯狀樣病毒型多，型間又很少有交叉反應，因此中和試驗應用較少。VNT在平底微量組織培養(yǎng)板中進行，用滅活血清樣品、l 000TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染量)的新澤西型(NJ)或印第安型(IN)VES病毒和預先制備Vero單層細胞懸液檢測未中和的病毒。試驗程序：

1）病毒：NJ或IN型VES病毒于Vero單層細胞單層上生長，并于液氮或-70 ℃保存。

2）被檢樣品：在試驗前，血清于56 ℃滅活30 min，陽性和陰性標準對照血清用同樣的方法處理。

3）病毒中和：從l∶4開始，將血清在平板上以2倍橫向連續(xù)稀釋，每份血清用2排孔，每孔加入相同體積的大約含l 000TCID5025μL的NJ或IN型VES病毒懸液，37 ℃孵育60 min進行中和，隨后，向長成單層的微量培養(yǎng)板上每孔加進50μL混合物，或?qū)⒑醒澹《净旌衔锖蚻50 μL Vero細胞懸液同時加到各孔內(nèi)，用合適的蓋子蓋緊，于5%CO2下37 ℃培養(yǎng)48～72 h，或用膠帶封板在普通條件下培養(yǎng)(實驗已證明1000TCID50的病毒滴度可以減少非特異性反應而維持較高的試驗敏感性)。

4）結(jié)果判定：沒有出現(xiàn)CPE的孔認為是被保護。當l 000TCID50的值在750～1330TCID50之間，而陽性和陰性標準血清的滴度在其平均值的2倍之內(nèi)時，用Spearmann-Karber方法計算終點滴度。每份血清100%的中和滴度以logl0表示。血清滴度值等于或大于1/32時，即判為VES陽性。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)具有快速、可靠、靈敏度高的優(yōu)點，不受補體和抗補體因子的影響而廣泛使用[2]。液相阻斷ELISA(LP-ELISA)是VES病毒抗體檢測和定量的首選方法。建議以病毒糖蛋白作為抗原，因其無感染性，檢測中和抗體、假陽性比VN試驗要低。試驗程序：

1）包被：用pH9.6的碳酸鹽／碳酸氫鹽緩沖液將兔抗血清或正常兔血清作適當稀釋[3-4]后包被ELISA板，37 ℃孵育l h或4 ℃過夜。之后，用磷酸鹽緩沖液水(PBS)洗板1次和l%的卵白蛋白(用PBS稀釋)室溫下封閉1 h。該板可直接使用或洗3次以后保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2）液相：從l∶4開始，將每份待檢血清在U型微量滴定板中2倍連續(xù)稀釋，每個稀釋度作雙份，將等體積的VES病毒NJ或IN糖蛋白稀釋液加到每個孔中，37 ℃孵育1 h，然后將50μL混合物轉(zhuǎn)移到包被的ELISA板中，置旋轉(zhuǎn)振蕩器上37 ℃反應30 min。

3）特異性抗體：用含0.05%吐溫-20、1%卵白蛋白、2%正常兔血清及2%正常牛血清(PBSTB)將抗VES病毒NJ和IN血清型的單價或多價豚鼠抗血清作適當稀釋，分別加到相應的包被兔血清孔內(nèi)，置旋轉(zhuǎn)振蕩器上37 ℃反應30 min。

4）酶結(jié)合物：將過氧化物酶／兔或山羊抗豚鼠IgG結(jié)合物用PBSTB作適當稀釋后加入各孔，置旋轉(zhuǎn)振蕩器上37 ℃反應30 min。

5）底物：每孔加H2O2活化的底物，在室溫下反應l5 min，隨后加入硫酸終止反應，用酶標儀測光吸收值。整個試驗均使用50μL試劑，每步之間反應板均用含0.05%吐溫20的PBS洗5次。所使用的試劑均做對照。

6）結(jié)果判定：按照Spearmann-Karber方法，以陰性血清對照降到50%時的log10表示50%終點滴度，滴度等于或大于1／20時判為陽性。

3.2.3 補體結(jié)合試驗

ELISA比補體結(jié)合試驗(CF)敏感，不受前補體和抗補體因子的影響。當沒有ELISA試劑時，可用CF試驗進行診斷。試驗程序：

1）抗血清：將豚鼠VES病毒抗NJ型的單價抗血清和豚鼠抗IN型VES病毒的多價抗血清，用巴比妥緩沖液(VB)稀釋成含2.5 CFU50(50%補體結(jié)合單位)的稀釋物，同相應的病毒作用后，并將其加到微量板相應孔內(nèi)。這些抗血清為ELISA中使用的特異性抗體血清。

2）待檢樣品：將待測樣品的抗原懸液加入血清孔中，抗原懸液的制備同IS-ELISA。

3）補體：將4 CHU50(50%補體溶血單位)加到上述含血清和抗原的各孔內(nèi)(試驗中也可選用7.5、10及20 CHU50)?？寡?、待檢樣品和補體的混合物于37 ℃孵育30 min。

4）溶血系統(tǒng)：用10 HU50(50%溶血單位)兔抗綿羊紅細胞(SRBC)血清致敏SRBC的VB懸液，加到各孔中，溶血系統(tǒng)(即2個體積的溶血系加3個體積的蒸餾水)在545 nm波長下吸收值為0.66?；旌衔镉?7 ℃孵育30 min，隨后，離心微量板，并用肉眼觀察反應。要求抗血清、被檢樣品和補體的量是25μL，而溶血系統(tǒng)的量是50μL。同時要做與抗血清、抗原、補體和溶血系統(tǒng)相應的對照?？梢杂帽任⒘堪宕?倍量的試劑在試管中作CF 50%試驗。這時，可用分光光度計在545 nm波長條件下讀取光吸收值表示試驗結(jié)果。

5）結(jié)果解釋：當各種對照符合要求，而一個型的抗血清在與其他型抗血清以及對照相比其樣品溶血小于20%時，則認為其相應的血清型是陽性。將CF試驗為陰性的野外樣品接種于細胞培養(yǎng)物或斷乳的小鼠，如果連傳3代均為陰性，該樣品被認為是VES病毒陰性。

3.2.4 免疫熒光試驗

將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便，特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低，而且每檢查一種抗原都就需要制備一種熒光抗體，此法常用于病毒等微生物的快速檢查。試驗程序：

1）將澄清組織懸液或水皰液接種于Leighton培養(yǎng)管及其25 cm2細胞瓶的培養(yǎng)細胞上。

2）37 ℃孵育1 h。

3）棄去接種物，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，然后用含有2.5%胎牛血清(FBS)的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

4）將接種的Leighton管細胞培養(yǎng)物置于33～35 ℃并觀察CPE。

5）接種后18～24 h，從接種每一樣品的Leighton管中取出培養(yǎng)的蓋片，用新澤西型(NJ)和印第安型(IN)VESV特異性熒光抗體(FA)結(jié)合物染色。

6）將其余的接種的Leighton管和25 cm2細胞瓶在35～37 ℃培養(yǎng)6 d以上，并每天觀察CPE。

7）接種后第7天，用FA結(jié)合物將Leighton管中剩余的培養(yǎng)蓋片染色。如果未觀察到熒光而且細胞瓶也無觀察到CPE，即可報告樣品為VES病毒分離陰性。

8）如果觀察到CPE，而FA染色陰性，則按照如上程序，用25 cm2細胞瓶中的細胞進行傳代培養(yǎng)。

3.3 豬水皰疹病的分子生物學診斷

VES的診斷技術正在不斷地改進和創(chuàng)新，已從病原學與血清學診斷技術擴展到了分子生物學診斷技術的領域。這些新技術的最大優(yōu)點體現(xiàn)在簡便、快速、精確、靈敏，以及檢樣處理的高通量化。

3.3.1 RT-PCR

近幾年發(fā)展起來的RT-PCR 技術，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，已成為病原體檢測的重要方法。趙啟祖等[5]首次應用 RT-PCR 方法，以SVEV VP3 區(qū)編碼 VPg和蛋白酶基因序列合成的引物，檢測了2株 SVEV 感染 IBRS-2 細胞中的病毒 RNA，在同一RT-PCR 緩沖體系中成功地擴增出了目的基因片段，用 RT-PCR 檢測 TCID50為 1.0×10-8.5和乳鼠 LD50為1.0×10-9.0的病毒細胞培養(yǎng)物時，其靈敏度可達 1.0×10-11以上，而正常IBRS-2細胞和 SVEV 感染的IBRS-2 細胞均未擴增出 DNA 片段。

表1 口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎及豬水皰疹病的鑒別[7]

3.3.2 PCR-ELISA

PCR-ELISA 相對于凝膠光密度定量，無論在靈敏度、特異性、精確度上都得到很大的提高，能滿足臨床診斷的要求。Callens等[6]根據(jù) RTPCR 和 ELISA 的原理，用地高辛標記的 dUTP 標記 212 bp 的擴增子，通過 RT-PCR-ELISA，無需使用巢式聚合酶鏈式反應即可對豬水皰病進行高效、特異地檢測。

4 豬水皰疹病的鑒別診斷

根據(jù)病豬突然高熱稽留，后唇、齒齦、舌、腭、鼻鏡以及四肢的蹄冠、蹄踵和趾間形成水皰，跛行，厭食等臨床癥狀和病理變化，可初步診斷本病。但由于本病臨床表現(xiàn)與口蹄疫、水皰性口炎及豬水皰病極為相似。因此，診斷本病必須與口蹄疫、水皰性口炎及豬水皰病進行鑒別。豬口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎和豬水皰疹病的鑒別診斷見表1。

由于控制豬水皰疹病的關鍵之一在于早期診斷，因此，探索一種高效、快速、敏感的檢測方法是今后發(fā)展的方向。目前，應用于實驗室診斷的方面如RT-PCR法等已能夠較敏感的診斷出SESV。有的診斷方法還在研究中，有待進一步完善。隨著VES的研究不斷深入，分子生物學技術的不斷發(fā)展，一定會有更靈敏，更準確，操作更簡便的VES診斷技術不斷出現(xiàn)和應用。

[1] 世界動物衛(wèi)生組織.哺乳動物,禽,蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局，譯.第4版.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2002.

[2] Kweon C H, Kwon B J, Kim I J,et al. Development of monoclonal antibody-linked ELISA for serodiagnosis of vesicular stomatitis virus(VSV-IN) using baculovirus expressed glycoprotein[J]. J Virol Methods,2005, 130(1-2):7-14.

[3] Harrsion Stephen C.Viral membrane fusion[J]．Nature Structural Molecular Biology, 2008, 15(7):690-698.

[4] Detje C N, Meyer T, Schmidt,et a1.Local type I IFN receptor signaling protects against virus spread within the central nervous system[J].Joumal nmunolo gy,2009,182(4):2297-2304.

[5] 趙啟祖，薛景山，謝慶閣，等．聚合酶鏈反應（PCR）檢測豬水皰疹病病毒的研究 [C]//青島：第3屆全國病毒學學術會議論文集，1994.

[6] Callens M，Clercq K．Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on a single tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection[J]．Journal of virological methods，1999（77）：87-99.

[7] 蔡寶祥.家畜傳染病學[M].第4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.