用HPLC-ESI-IT-MSn法研究慶大霉素C1a的雜質(zhì)譜

楊 昊，袁耀佐，趙 恂，譚 力，張 玫，錢 文

江蘇省食品藥品檢驗所，南京 210009

臨床上使用的慶大霉素（Gentamicin，GM）是由小單孢菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)相近的、多組分的氨基糖苷類抗生素，以 C 族復(fù)合物（C1、C2、C1a、C2a）為主，圖1為慶大霉素及其部分雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[1]。由于它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，故生物活性和毒性不相同。C1毒副作用小，不易耐藥，但療效不如C2和C1a，而C2和C1a雖療效高，但毒性大且易耐藥[2]。趙敏等[3]的研究，以慶大霉素 C1a（GMC1a）為母核，經(jīng)半合成改造，得到另一個新抗生素——依替米星（Etimicin，ETM）。該藥具有抗菌活性強(qiáng)、療效好、毒性低、抗耐藥菌等優(yōu)點，已被《中國藥典》收載。工業(yè)化生產(chǎn)ETM需要大量高純度低價格的GMC1a，為此，趙敏等[4]利用紫外光和氯化鋰復(fù)合因子處理小諾霉素產(chǎn)生菌棘孢小單孢菌JIM-401，獲得一發(fā)酵產(chǎn)生慶大霉素C1a單一組分的突變株JIM-202，又通過推理育種技術(shù)[5]，獲得慶大霉素C1a單組分高產(chǎn)菌，并在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

圖1 慶大霉素及部分雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

雜質(zhì)譜（impurity profile）的分析，即分析樣品中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量的分布情況，在原料藥中的應(yīng)用越來越廣泛[6]，但在中間體中的應(yīng)用鮮見，作者在研究依替米星的雜質(zhì)譜時發(fā)現(xiàn)，不同來源慶大霉素C1a合成的依替米星，雜質(zhì)譜不同，有時還有較大的差異，甚至可能產(chǎn)生含量較大的新雜質(zhì)，其安全性如何在臨床上沒有得到驗證，直接給產(chǎn)品帶來安全隱患。從全面質(zhì)量管理的理念而言，有必要對慶大霉素C1a的雜質(zhì)譜進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

隨LC-MS聯(lián)用技術(shù)的成熟，LC-MSn在氨基糖苷類抗生素雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用報道很多[7-9]，因氨基糖苷類抗生素極性很大，在反相色譜柱上不保留，文獻(xiàn)中大多采用在流動相添加多氟有機(jī)酸改善色譜保留，而氟有機(jī)酸影響質(zhì)譜的離子化效率，尤其是當(dāng)采用電噴霧離子源時，正離子的形成幾乎是不可能的，早期的文獻(xiàn)中，消除離子抑制效率主要采用TFAfix技術(shù)[10]，即根據(jù)實際情況在柱后添加揮發(fā)性小于多氟有機(jī)酸的其他有機(jī)酸，由于在柱后添加需要增加泵系統(tǒng)，比較費事，后來部分實驗采用在流動相直接添加低揮發(fā)性有機(jī)酸或通過用氨水調(diào)節(jié)流動相pH至2.0的辦法。Grahek[1]在研究慶大霉素雜質(zhì)譜時還發(fā)現(xiàn)，采用APCI源代替ESI源，可以使靈敏度得到明顯提高。上述方法在一定程度上解決了氨基糖苷類抗生素的色譜分離和質(zhì)譜檢測之間的矛盾，但在質(zhì)譜儀中會有大量的多氟有機(jī)酸殘留，給質(zhì)譜儀的維護(hù)帶來困難，長期使用，會大大降低儀器檢測靈敏度，為此，作者在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[11]，采用寬pH范圍的色譜柱，在高pH值的流動相中，分離氨基糖苷類抗生素，用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行檢測，并采用多級質(zhì)譜對雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，成功地分析了依替米星[12]、小諾霉素[13]、奈替米星、西索米星的雜質(zhì)譜，該方法在國內(nèi)外均為首次報道。

本文是在文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，建立了用于慶大霉素C1a雜質(zhì)譜研究的HPLC-ESI-IT-MSn方法，從慶大霉素C1a樣品中共檢出13個雜質(zhì)，采用與雜質(zhì)對照品比對色譜保留時間、一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜的方法，對2個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證；利用已經(jīng)總結(jié)出來的氨基糖苷類抗生素的特征裂解碎片離子和質(zhì)譜裂解規(guī)律[12-13]，根據(jù)一級、二級質(zhì)譜信息，對另外12個雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定。

1 材 料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 LC/MSD Trap液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Agilent公司）。

慶大霉素C1a（常州方圓制藥有限公司）；慶大霉素、依替米星、小諾霉素等對照品（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純；其余均為分析純。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱:Gemini NX C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，美國 Phenomnex 公司)；流動相:[水-氨水-冰醋酸（96∶3.6∶0.4）]-甲醇（85∶15）；流速:1 mL·min-1；柱溫:35℃；進(jìn)樣量:20μL；柱后分流比:7∶3。

離子源:ESI源；離子源溫度:350℃；霧化室壓力:275.8 kPa；干燥氣流速:10 L·min-1；離子掃描范圍:100～900 m/z；正離子方式檢測。

2 方法與結(jié)果

2.1 慶大霉素C1a的LC-MS分析

取慶大霉素C1a適量，用水溶解并稀釋制成含慶大霉素C1a約5 mg·mL-1的溶液，進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描（Full scan）和二級質(zhì)譜離子全掃描（Full scan-MS2）。 圖 2為 LC-MS的總離子流圖（TIC）；表 1為慶大霉素C1a及其主要雜質(zhì)的色譜保留時間及對應(yīng)的一、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

圖2 慶大霉素C1a的LC-MS（TIC）圖

表1 慶大霉素C1a及主要雜質(zhì)LC-MS測定數(shù)據(jù)

2.2 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定

雜質(zhì)1的[M+H]+m/z 469，與慶大霉素A的分子量吻合 （MW 468），其二級質(zhì)譜為 [M+H]+m/z 451、420、366、348、324、308、205、187、163、146， 用慶大霉素A的結(jié)構(gòu)解析，各碎片離子均能得到合理解釋，裂解途徑如圖3所示。鄭衛(wèi)等[14]報道小單孢菌FM-203能產(chǎn)生慶大霉素A組分，旁證結(jié)構(gòu)推定的合理性，表明雜質(zhì)1為慶大霉素A。

圖3 雜質(zhì)1（慶大霉素A）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)2的[M+H]+m/z 468，其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z 450、419、365、347、323、308、205、187、163、146，其分子量比慶大霉素A少1 Da，與慶大霉素A二級質(zhì)譜對應(yīng)離子比較，碎片離子m/z 348、308、205、187、163、146 完全相同， 碎片離子 m/z 450、419、365、347、323少1 Da，可見，雜質(zhì)2具有慶大霉素A的B+C環(huán)結(jié)構(gòu)，但A環(huán)結(jié)構(gòu)中某個羥基應(yīng)被氨基替換，可能的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 雜質(zhì)2二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)3的[M+H]+m/z 322，與慶大霉素C1a脫去A環(huán)得到的降解產(chǎn)物（B+C環(huán)）的加氫離子的質(zhì)荷比吻合，提示該組分為慶大霉素C1a失去A環(huán)的降解物，即加洛糖胺（garamine），其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z 205、187、163、160、142、129、112，各碎片離子均能得到合理解釋，裂解途徑如圖5所示，證明雜質(zhì)3為加洛糖胺。

圖5 雜質(zhì)3（加洛糖胺）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)4的[M+H]+m/z 483，與慶大霉素B的分子量吻合，其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z 434、366、348、324、323、322、307、255、228、189、163、144， 各 碎 片離子均能得到合理解釋，裂解途徑如圖6所示，黎俊等[15]發(fā)現(xiàn)慶大霉素C1a的產(chǎn)生菌（棘孢小單孢菌）可以產(chǎn)生慶大霉素B，旁證該結(jié)構(gòu)推定的合理性，即雜質(zhì)4為慶大霉素B。

圖6 雜質(zhì)4（慶大霉素B）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)5的[M+H]+m/z 305，與 gentamineC2、C2a、C2b（小諾霉素脫C環(huán)的降解物）相同（如圖1所示），其二級質(zhì)譜為 [M+H]+m/z 288、163、143、126、112，用上述三候選結(jié)構(gòu)對二級質(zhì)譜進(jìn)行解析，均能使所有碎片得到合理解釋，考慮到樣品中小諾霉素（為主要雜質(zhì)），雜質(zhì)5的結(jié)構(gòu)為gentamine C2b可能性更大。見圖7。

圖7 雜質(zhì)5（gentamine C2b）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)6的[M+H]+m/z 431，與西索米星的分子量差17 Da，提示可能比其少1分子氨，二級質(zhì)譜為m/z 332、314、296、272、269、254、227、199、173、163、160、154，其中m/z 163、160分別為西索米星的 B環(huán)和C環(huán)的特征離子[8]，提示雜質(zhì)6中有這兩特征基團(tuán)，由此可知缺少的1分子氨應(yīng)在A環(huán)結(jié)構(gòu)中，根據(jù)上述分析，雜質(zhì)6可能的結(jié)構(gòu)如圖8所示，該結(jié)構(gòu)可以合理解釋二級質(zhì)譜中的主要碎片離子。

圖8 雜質(zhì)6二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)7的[M+H]+m/z 446，其二級質(zhì)譜為318、290、160、142；目前無分子量為445 Da的氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)報道，僅根據(jù)這些質(zhì)譜信息無法推測其結(jié)構(gòu)。

雜質(zhì)8的[M+H]+m/z 450，其二級質(zhì)譜碎片離子 m/z 433、308、288、205、187、163、143，文獻(xiàn)[1]報道慶大霉素原料中 [M+H]+m/z 450組分除慶大霉素C1a外，還發(fā)現(xiàn)有慶大霉素Ⅶ-2和慶大霉素Y-02077H（如圖1所示），用這兩結(jié)構(gòu)均能合理解釋，故從二級質(zhì)譜上無法區(qū)分A環(huán)的6位上的甲基的連接方式，進(jìn)一步用多級質(zhì)譜對特征離子m/z 143進(jìn)行分析，得到三級質(zhì)譜為 m/z 143、126、109，表明A環(huán)中有兩個自由的氨基，這與慶大霉素Ⅶ-2結(jié)構(gòu)吻合，表明雜質(zhì)8為慶大霉素Ⅶ-2，其二級質(zhì)譜裂解過程如圖9所示。

雜質(zhì)9的[M+H]+m/z 492，比小諾霉素的[M+H]+大 28 Da，其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z 475、350、305、188、163、143,其中m/z是小諾霉素的A+B環(huán)特征離子，m/z 163是慶大霉素C1a的B環(huán)特征離子[12-13]，提示雜質(zhì)9中有小諾霉素的A+B環(huán)結(jié)構(gòu)，增加的結(jié)構(gòu)部分應(yīng)連接在C環(huán)上，文獻(xiàn)[1]報道，慶大霉素原料中分離出3個 [M+H]+m/z 492組分的結(jié)構(gòu)，其中XK-62-7的結(jié)構(gòu)能合理解釋其二級質(zhì)譜，雜質(zhì)9可能的結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖9 雜質(zhì)8（Ⅶ-2）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

圖10 雜質(zhì)9（XK-62-7）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)10和雜質(zhì)13的一級、二級質(zhì)譜及色譜保留分別與西索米星和小諾霉素一致（質(zhì)譜及色譜保留時間見表1），即為雜質(zhì)10為西索米星，雜質(zhì)13為小諾霉素。

雜質(zhì)11的[M+H]+m/z 451，比慶大霉素C1a的分子量多1 Da，其二級質(zhì)譜為[M+H]+m/z 434、334、322、292、275、205、163、160、142， 其 中 m/z322、205、163、160、142 是慶大霉素 C1a中 B+C 環(huán)的特征離子[12-13]，提示雜質(zhì)11結(jié)構(gòu)中有慶大霉素C1a的B+C環(huán)結(jié)構(gòu)，增加的1 Da應(yīng)發(fā)生在A環(huán)上，即雜質(zhì)11的結(jié)構(gòu)為慶大霉素C1a的A環(huán)中某個氨基為羥基替代而得，如圖11所示。

圖11 雜質(zhì)11二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)12的[M+H]+m/z 462，比小諾霉素的分子量（[M+H]+m/z 464）少2Da，提示結(jié)構(gòu)中有雙鍵，其二級質(zhì)譜為 444、413、322、303、285、254、205、163、160、142，其中碎片離子 m/z 322、205、163、160 為小諾霉素的B+C環(huán)特征離子[12-13]在A環(huán)上，倪雍富等[16]曾從橄欖星孢小單孢菌無錫亞種M-41的發(fā)酵液中分離到威達(dá)米星（verdamicin），該結(jié)構(gòu)可以合理解釋上述二級質(zhì)譜中所有碎片離子，可見雜質(zhì)12可能為威達(dá)米星，結(jié)構(gòu)如圖12所示。

圖12 雜質(zhì)12（verdamicin）二級質(zhì)譜可能的裂解途徑

3 討 論

本研究首次建立用于慶大霉素C1a中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推定的HPLC-ESI-IT-MSn方法，并從慶大霉素C1a中檢出13個雜質(zhì)，對其中的12個雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推定 （見表1），該方法可以用于本品雜質(zhì)譜的研究。由于樣品有限，未對不同批次、不同來源的慶大霉素C1a中雜質(zhì)的種類和含量之間的變化情況進(jìn)行分析。

推定結(jié)構(gòu)基本思路因有無雜質(zhì)對照品而異。對有對照品的雜質(zhì)，則通過比對兩者的色譜保留時間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜，來確證結(jié)構(gòu)。對無對照品的雜質(zhì)，則利用已經(jīng)總結(jié)出來的氨基糖苷類抗生素的特征裂解碎片離子和質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過一級、二級質(zhì)譜或多級質(zhì)譜信息，對未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)，有時還需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)或生產(chǎn)工藝，對結(jié)果進(jìn)行佐證。

通過二級或多級質(zhì)譜信息推導(dǎo)結(jié)構(gòu)時，對結(jié)構(gòu)中部分基團(tuán)的位置或空間構(gòu)型無法確定，這是用LC-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的一個缺陷。由于這些雜質(zhì)在樣品中含量極微，用富集的制備方法獲得雜質(zhì)精制品的工作量大，甚至還需要特殊的設(shè)備，成為未知雜質(zhì)研究的瓶頸所在，期待更先進(jìn)的分析手段如LC-NMR加速發(fā)展來推動這方面工作的深入研究。

與其他氨基糖苷類抗生素一樣，慶大霉素C1a中含有很多氨基和羥基，溶液狀態(tài)下易離子化，故實驗中選用電噴霧離子化方法，分別用正、負(fù)離子模式掃描慶大霉素C1a溶液，結(jié)果顯示，正離子模式下檢測靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于負(fù)離子檢測模式，合理的解釋為:流動相中氨水的揮發(fā)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于冰醋酸，電噴霧形成的液滴在去溶劑時氨水部分先揮發(fā)去除，使殘存液滴由原先的堿性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝裕峁潆x子，慶大霉素C1a及其雜質(zhì)經(jīng)庫侖爆炸后呈現(xiàn)為加氫離子，故實驗中選擇正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

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