祛痰除濕劑對(duì)離體培養(yǎng)的骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA 表達(dá)的影響

孟祥奇，黃桂成

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京215000)

骨關(guān)節(jié)炎是一類與年齡相關(guān)的退變性疾病，在軟骨再生和修復(fù)過程中失去動(dòng)態(tài)平衡、關(guān)節(jié)炎癥及機(jī)械負(fù)重等因素均會(huì)加重病情［1～3］，治療棘手 。2011年3～10月，我們觀察了祛痰除濕劑對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響，旨在探討祛痰除濕劑在骨關(guān)節(jié)炎治療中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF雄性10周齡SD大鼠30只，體質(zhì)量約300 g。培養(yǎng)箱(Espec BNA-31 1型)、倒置顯微鏡(Olympus U-RFCT50)、恒溫?fù)u箱、低溫離心機(jī)(LXJ-1I型，上海醫(yī)療機(jī)械三廠)、Rotor Gene 3000型四通道PCR儀(澳大利亞Cobett公司);Mastercycler Personal型基因擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)。0.25%胰蛋白酶(Promega公司)、高糖DMEM(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青公司)、TRizol試劑(美國(guó)Sigma公司);逆轉(zhuǎn)錄酶(北京天根生化科技有限公司);15份行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的病變膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本(均用手術(shù)尖刀片削取關(guān)節(jié)表面軟骨，放入盛有PBS的培養(yǎng)皿中，清除表面血污及附著的其他組織)。IL-1、IL-6、TNF-α引物及內(nèi)參照 βactin引物序列(華大基因生物技術(shù)有限公司)。

1.2 含藥血清制備 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與給藥組各15只，分別制備空白生理鹽水(NS)血清和含藥血清。按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量，配成溶液，給藥組予祛痰除濕劑(含制南星、制川烏、薏苡仁、刺五加、丹參、地龍等中藥)2 mL/kg灌胃，對(duì)照組以生理鹽水2 mL/kg灌胃，均2次/d，連續(xù)3 d。末次灌胃1 h后分別采集兩組腹總動(dòng)脈血，靜置1 h，2 000 r/min離心10 min，抽取血清，56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22μm濾膜抽濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［5］，用含青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的PBS沖洗膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本數(shù)次，移入超凈臺(tái)，將軟骨組織剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm，均勻敷貼于半徑為5 cm培養(yǎng)皿底壁上，其中組織塊約占培養(yǎng)皿底1/3面積，加入DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，20%胎牛血清)，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。開始第4～5天組織貼壁后換液，以后隔天換液，第15～20天可見少量梭形、短梭形細(xì)胞散在分布于組織塊周圍，25 d左右可見細(xì)胞自融，1個(gè)月左右細(xì)胞長(zhǎng)滿大部分(70% ～80%)培養(yǎng)皿底壁后棄舊培養(yǎng)液，用消毒無(wú)菌鑷子移除組織塊(組織塊可繼續(xù)加入20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)原代細(xì)胞)，用PBS液清洗3次，加入適量的0.25%胰蛋白酶，室溫下振蕩2～5 min。鏡下觀察貼壁細(xì)胞逐漸脫落，變成圓形，個(gè)別細(xì)胞開始浮游，加入新培養(yǎng)液，吹打混勻，離心1 000 r/min，5 min，收集細(xì)胞，接種培養(yǎng)，按1∶2比例傳代，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 含藥血清干預(yù)及 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)測(cè)定 取第三代傳代軟骨細(xì)胞等量置于6孔板中并分為 A、B、C、D、E、F、G 組。A 組加入 DMEM，B組加入5%祛痰除濕劑血清，C組加入5%NS血清，D組加入10%祛痰除濕劑血清，E組加入10%NS血清，F(xiàn)組加入20%祛痰除濕劑血清，G組加入20%NS 血清，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于 4、8、24、48、72 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用Real Time-PCR法檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，行方差齊性檢驗(yàn)，多組樣本間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

各組不同時(shí)間點(diǎn)軟骨細(xì)胞 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)分別見表1、表2、表3。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)軟骨細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)(ˉx±s)

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)軟骨細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)(ˉx±s)

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)橹行?，累及關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)其他結(jié)構(gòu)的慢性炎癥。鑒于關(guān)節(jié)軟骨退變是骨關(guān)節(jié)炎的最直接原因，故目前對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究多集中于對(duì)關(guān)節(jié)軟骨退變的研究上。目前骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、運(yùn)動(dòng)不當(dāng)、氣候不佳和不良的生活習(xí)慣等外界因素，內(nèi)分泌紊亂，損傷，免疫學(xué)異常，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞因子及酶的作用等均可引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變［4］。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞自身在受到不同刺激出現(xiàn)損傷或炎癥時(shí)，可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，其中IL-1、IL-6、TNF-α 等均為炎性因子，不僅能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞與粒細(xì)胞吞噬趨化，釋放溶酶體酶、氧自由基、組胺等，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，加重免疫損傷［6］。Goldring等［7］發(fā)現(xiàn)，IL-1、IL-6、TNF-α 在軟骨及滑膜中表達(dá)增高與炎癥破壞及炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。據(jù)報(bào)道，膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清中 IL-1、IL-6、TNF-α明顯升高。IL-6可增加滑膜組織的炎癥細(xì)胞、刺激軟骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)放大IL-1，增加MMPs的合成作用，抑制蛋白多糖產(chǎn)生，但由于IL-6能誘導(dǎo)TIMP的產(chǎn)生，而不是MMPs，故此因子被認(rèn)為與限制蛋白分解損傷的負(fù)反饋機(jī)制有關(guān)。TNF-α導(dǎo)致關(guān)節(jié)病變的可能機(jī)制是:①刺激滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞合成PGE2和膠原酶，刺激血管擴(kuò)張滲出，促進(jìn)破骨細(xì)胞的溶骨作用，造成關(guān)節(jié)破壞;②促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成與分泌MMPs，引起軟骨的吸收降解破壞，促使成纖維細(xì)胞增生;③對(duì)創(chuàng)傷局部血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮多方面的作用，包括激活和損傷作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，可產(chǎn)生形態(tài)和功能變化，使其通透性增加，加重局部組織炎性水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)病機(jī)辨證是“氣虛血瘀，本虛標(biāo)實(shí)，痰濕阻滯”。祛痰除濕劑由制南星、丹參、薏苡仁等中藥組成，由經(jīng)典成藥小活絡(luò)丹化裁而來(lái)。制南星燥濕化痰，祛風(fēng)止痙，還具有散結(jié)消腫的作用;薏苡仁可利水滲濕，健脾除痹。對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫有促進(jìn)作用，還能降血鈣、延緩衰老，提高機(jī)體的免疫能力;制川烏能祛除寒濕，溫經(jīng)止痛;刺五加祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨，還能利水腫?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明丹參具有活血祛瘀，涼血消癰，除煩安神作用，其有效成分丹參酮等能抑制血小板黏附聚集和血栓形成，降低血液黏度和骨內(nèi)高壓，提高關(guān)節(jié)軟骨超氧化物歧化酶活性，從而能更有效地清除氧自由基，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性變等作用?？梢婌钐党凉駝┦峭ㄟ^多系統(tǒng)和多靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。本研究結(jié)果表明，采用祛痰除濕劑含藥血清干預(yù)后，退變軟骨細(xì)胞中 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)均下調(diào)，以 10%祛痰除濕劑含藥血清作用最明顯，IL-1、IL-6、TNF-α mRNA分別于10%祛痰除濕劑含藥血清作用8、24、48 h后降至最低。據(jù)報(bào)道，中藥復(fù)方血清藥理實(shí)驗(yàn)中體外培養(yǎng)液中的含藥血清濃度以臨床等效劑量為基準(zhǔn)，其中10%較為合適，一般不超過20%，過高或過低均不宜［8］。本研究為探索性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示以10%含藥血清濃度效果最好，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，此為祛痰除濕劑臨床等效劑量治療骨關(guān)節(jié)炎提供了可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果提示，10%祛痰除濕劑含藥血清可能通過影響膝關(guān)節(jié)軟骨中IL-1、IL-6、TNF-α及相關(guān)代謝酶mRNA表達(dá)而及減輕炎癥反應(yīng)，延緩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的退變。但本實(shí)驗(yàn)由于受實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)水平限制，且正常人的軟骨組織取材較困難，故缺乏正常的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作對(duì)照，具體的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

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