腦癱患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)特性分析

王亞莉，陳國軍，方 鳳，陳 麗，張 青，劉厚奇

(1浙江武警總隊(duì)醫(yī)院，浙江嘉興314000;2第二軍醫(yī)大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所)

間充質(zhì)干細(xì)胞因具有強(qiáng)大的分化能力和組織修復(fù)能力廣泛用于腦癱的治療。據(jù)報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human marrow mesenchymal cells，hMSCs)可在體外成功培養(yǎng)、分化為神經(jīng)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨組織、骨組織等［1］，發(fā)揮修復(fù)損傷組織的作用。自2010年12月以來，我院開始采用自體hMSCs體外轉(zhuǎn)化神經(jīng)干細(xì)胞治療腦癱，取得較好效果?，F(xiàn)對hMSCs體外培養(yǎng)生長特性進(jìn)行分析，旨在指導(dǎo)臨床把握治療時(shí)機(jī)和提高種子細(xì)胞質(zhì)量，提高治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 MSC培養(yǎng)基(含DMEM、MCDS、優(yōu)級FBS、LAA，Sigma 公司)，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO公司)，PBS緩沖液，bFGF，倒置顯微鏡，CD34、CD109、CD29、CD44 單抗，大皿(100 mm)、中皿(60 mm)培養(yǎng)皿。38份骨髓樣本取自38例腦癱患者［(男22例，女16例，年齡1～35歲;其中1～3歲11例(嬰幼兒組)、4～6歲9例(學(xué)齡前組)、7～19歲10例(學(xué)齡組)，20～35歲8例(成人組)］?；颊呔炇鹬橥鈺ㄟ^醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 hMSCs原代細(xì)胞(P0)分離培養(yǎng) 各組均根據(jù)0.6～1 mL/kg體質(zhì)量于右側(cè)髂后上嵴采集骨髓12～50 mL，骨髓收集管中按100 U/mL加入肝素抗凝，骨髓樣分裝到多支15 mL離心管，每管5 mL，加入等量PBS溶液，配平，離心7 min，1 000 r/min。離心結(jié)束小心取出，用移液管抽取上層液體，棄掉，用吸管抽取中間白膜層(盡量少帶入紅細(xì)胞)，抽至新管內(nèi)，加入PBS清洗2次，用培養(yǎng)基重懸后倒入培養(yǎng)皿中。根據(jù)骨髓量的多少以及白膜層是否明顯決定放入大皿或中皿。置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育，48 h半量換液，4 d后全量換液，棄去大量的懸浮細(xì)胞，以后每3～4 d根據(jù)培養(yǎng)基顏色換液。

1.3 原代及傳代細(xì)胞生長形態(tài)特征及細(xì)胞增長速率計(jì)算 原代細(xì)胞一般在分離后6～9 d傳代1次，P1以后于細(xì)胞生長達(dá)到覆蓋培養(yǎng)皿的60% ～80%后予1∶2或1∶3傳代。從第2代以后，每次傳代時(shí)行hMSCs鑒定:棄去上清，用PBS清洗2次，滴加0.05%的Trypsin-EDTA胰酶消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞觸角收縮，細(xì)胞變成圓形后，添加培養(yǎng)基終止消化，制成(1～3)×106/mL的細(xì)胞懸液分裝于不同培養(yǎng)皿中，3～4 d根據(jù)培養(yǎng)基顏色換液。流式細(xì)胞儀檢測示CD34、CD109陰性，CD29和CD44陽性率均＞90%證實(shí)為hMSCs。倒置相差顯微鏡逐日觀察原代及傳代細(xì)胞生長情況和形態(tài)特征。并計(jì)算各組細(xì) 胞 增 長 速 率，細(xì) 胞 增 長 速 率 =(傳代天數(shù)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示、行t檢驗(yàn)，率的比較行 χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

P0第2天可見貼壁生長，先呈圓點(diǎn)形，逐漸伸出觸角成梭形，原代細(xì)胞貼壁較慢，24 h后逐漸貼壁，換液培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞漸形成集落。嬰幼兒組、學(xué)齡前及學(xué)齡組hMSCs形成集落明顯，細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞呈長梭形較集中，生長速度快;成人組hMSCs形成集落小，細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞較大呈短梭形散在分布。各組細(xì)胞成簇生長，在雜質(zhì)細(xì)胞較多時(shí)培養(yǎng)基由鮮紅轉(zhuǎn)為暗紅，當(dāng)?shù)?天全量換液后雜質(zhì)細(xì)胞減少，培養(yǎng)皿中呈現(xiàn)培養(yǎng)基本身的粉紅色，呈簇生長的細(xì)胞簇面積增大，中心較密集，似菊花狀。各組于6～9 d進(jìn)行傳代第1次(P1)，P1以后的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中呈均勻分布，生長速率逐漸增快。各組細(xì)胞傳代時(shí)間情況見表1，細(xì)胞增長速率比較見表2。

表1 各組細(xì)胞傳代時(shí)間(d，ˉx±s)

表2 各組細(xì)胞增長速率(%，ˉx±s)

3 討論

hMSCs具有可分離并體外培養(yǎng)與擴(kuò)增的特性，組織修復(fù)性能好。大量研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)腦損傷［2，3］，而患者間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞工程質(zhì)量是關(guān)鍵因素，骨髓hMSCs的含量、質(zhì)量、活性等隨著年齡的增長而下降［4，5］。陳國軍等［6］曾對 11 個(gè)月 ～3 歲、4 ～20 歲、21歲～40歲以及41～60歲的20例患者的hMSCs體外培養(yǎng)增殖速度與傳代時(shí)間進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)40歲以內(nèi)患者首次傳代時(shí)間無明顯差異，＜20歲者P1傳代時(shí)間明顯短于＞20歲者，且培養(yǎng)達(dá)到治療數(shù)量細(xì)胞所需時(shí)間明顯短于＞20歲者。

本研究結(jié)果顯示，腦癱患者無論年齡大小，其hMSCs均可成功于體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增。原代細(xì)胞貼壁較慢，且貼壁不穩(wěn)固，可能因培養(yǎng)皿中有較多的紅細(xì)胞等其余雜質(zhì)細(xì)胞，影響間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁，故半量換液或全量換液過程中動(dòng)作一定要輕柔，切忌劇烈晃動(dòng)，以免影響細(xì)胞的貼壁生長;貼壁后的細(xì)胞呈簇生長，在培養(yǎng)皿中不是均勻鋪開，所以一般6～9 d無論細(xì)胞生長是否覆蓋培養(yǎng)皿的60%以上均應(yīng)給予傳代，否則細(xì)胞聚集在一起出現(xiàn)老化現(xiàn)象。原代細(xì)胞傳代時(shí)，呈簇生長的細(xì)胞被吹散開來，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻覆蓋培養(yǎng)皿，有利于細(xì)胞的貼壁增殖。經(jīng)過首次傳代后大量的紅細(xì)胞已被清除，P1以后的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中呈均勻分布，培養(yǎng)基澄清透明容易觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，兒童的hMSCs與成人相比倍增時(shí)間短，形成的集落多，其 MSCs用于組織工程和細(xì)胞治療較為理想［7，8］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，＜20歲的3個(gè)年齡組 hMSCs生長速度均明顯快于成人組，P1～P2代細(xì)胞增殖速度較快，傳代需要的時(shí)間短，P3～P4代細(xì)胞增長速率逐漸減慢。而成人組hMSCs細(xì)胞快速生長期不明顯。

綜上所述，腦癱患者自體hMSCs是理想的種子細(xì)胞，具有取材方便，易于培養(yǎng)、擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn);＜20歲者的hMSCs培養(yǎng)速度快，生長效率高，在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)可獲取足夠細(xì)胞數(shù)。

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