中國廣西人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多態(tài)性研究

藍(lán) 艷，盧 冬，王春芳，潘國剛，韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

Nogo基因是新近發(fā)現(xiàn)的軸索生長抑制因子(Neurite growth inhibitor)，具有抑制中樞神經(jīng)再生的作用［1］。RTN4基因存在多個位點(diǎn)的基因多態(tài)性，與頸部的鱗狀細(xì)胞癌、室間隔缺損、精神分裂癥、抑郁癥、擴(kuò)張性心肌病發(fā)生的關(guān)系是目前研究熱點(diǎn)［4～7］。Nogo-C 是RTN4家族中重要成員之一，在3'-非翻譯區(qū)存在rs17046518 G/A單核苷酸多態(tài)性。目前，有關(guān)Nogo-C基因rs17046518 G/A多態(tài)性的研究國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。2011年1～12月，我們采用單堿基延伸PCR技術(shù)研究了廣西地區(qū)健康人群Nogo-C基因3'-非翻譯區(qū)單核苷酸多態(tài)性，并與人類基因組計(jì)劃(Hapmap)公布的四個人群(歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，旨在探討Nogo-C基因3'-非翻譯區(qū)基因多態(tài)性在不同種族正常人群中的分布差異，為人類學(xué)及群體遺傳學(xué)研究提供前瞻性基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取廣西地區(qū)無血緣關(guān)系的個體199例，其中男118例，女81例;年齡25～86歲。均為廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢健康者，各項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均正常。

1.2 Nogo-C基因型檢測 采集受檢者靜脈血2 mL，用EDTA-K2抗凝;采用改良碘化鈉法提取白細(xì)胞基因組DNA，－70℃保存?zhèn)溆谩２捎脝螇A基延伸PCR技術(shù)檢測Nogo-C基因3'-非翻譯區(qū)rs17046518 G/A位點(diǎn)多態(tài)性的分布:根據(jù) Nogo-C基因rs17046518 G/A位點(diǎn)多態(tài)性與已知的DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴(kuò)增Nogo-C基因包含rs17046518 G/A位點(diǎn)堿基的DNA片段的引物，上游引物序列:5'-AGGGGTGTGGGGAGGAGTGACA-3'，下 游 引 物 序列:5'-GGGGGTGGCATGAAACACAATGA-3'，延伸引物:5'-GGGGGGTCGATGTGAGGCAGGTAGGAAGAA-3'。Nogo-C的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，其中含10 × PCR 緩沖液 2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶(SAP)(from Promega)和外切酶I(EXO I)(from Epicentre)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用SAP純化后在ABI3130XL上樣。SNP分型用 GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)分析。將Nogo-C基因rs17046518 G/A多態(tài)性分布頻率與人類基因組計(jì)劃 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)公布的四個人群(歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人)的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 247 bp。經(jīng)ABI3130XL基因檢測儀SNP分型結(jié)果顯示rs17046518 G/A位點(diǎn)檢測到AA、GA和GG三種基因型?；驕y序進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果(圖1)。Nogo-C基因rs17046518 G/A位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，即所選的研究樣本具有群體代表性。其中rs17046518 G/A位點(diǎn)基因型以AA型最為常見，占69.8%;其等位基因以A型頻率最高，占82.4%。其基因型及等位基因頻率分布在男女性別間比較無顯著性差異 (表1)。Nogo-C基因多態(tài)性基因型及等位基因的分布頻率與歐洲人和非洲人比較差異均有顯著性(P均＜0.05)，而與日本東京人和中國北京人比較差異無顯著性(表2)。

圖1 Nogo-C基因rs17046518 G/A測序圖

表1 Nogo-C基因型及等位基因頻率在廣西地區(qū)人群中的分布

表2 不同種族及地區(qū)人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多態(tài)性分布頻率比較

3 討論

Nogo是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中發(fā)現(xiàn)的一種抑制軸突生長的蛋白，編碼Nogo蛋白的基因被稱為Nogo基因。由于啟動子和mRNA剪切方式不同，Nogo基因能表達(dá)出3種mRNA的轉(zhuǎn)錄體，其編碼的蛋白質(zhì)分別為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，三者均屬于網(wǎng)狀蛋白(Reticulon protein，RTN)家族第四成員［2］。Nogo-C相對分子質(zhì)量最小，由199個氨基酸殘基組成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞，外周組織中大部分存在于骨骼肌細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，心臟中亦有少量分布，在抑制神經(jīng)再生、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡及參與腫瘤發(fā)生等過程中起重要作用［8～10］。Nogo-C 基因位于 2 號染色體短臂上(2p13-14)，編碼基因?yàn)?RTN4［3］，由 7 個外顯子和 6個內(nèi)含子組成，Nogo-C基因 3'-非翻譯區(qū)存在rs17046518 G/A單核苷酸多態(tài)性，這種基因多態(tài)性的存在可能影響Nogo-C基因功能，進(jìn)而可能影響到Nogo-C基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，正確分析和闡明Nogo-C基因多態(tài)性在不同種族和地域人群中的分布特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究不同人群中Nogo-C基因多態(tài)性與某些疾病發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系提供理論依據(jù)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs17046518 G/A位點(diǎn)表現(xiàn)出AA、GA和GG 3種基因型，以AA型最為常見，其等位基因以A最為常見。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Nogo-C基因rs17046518 G/A位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率在男女組間比較無顯著性差異，提示該位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率可能與性別無相關(guān)性。比較分析發(fā)現(xiàn)，我國廣西健康人群中 Nogo-C基因rs17046518 G/A位點(diǎn)G等位基因頻率顯著高于歐洲人和非洲人;與日本人和中國北京人群比較差異無顯著性，提示Nogo-C基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在明顯差異，這一結(jié)果符合遺傳學(xué)規(guī)律，即親緣關(guān)系越近，其基因型分布越相似，反之則差異越顯著。

綜上所述，中國廣西人群 Nogo-C基因rs17046518 G/A位點(diǎn)表現(xiàn)出AA、GA和GG 3種基因型，以AA型最為常見，其等位基因以A最為常見，與性別無相關(guān)性。Nogo-C基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在明顯差異，符合遺傳學(xué)規(guī)律。對中國廣西人群Nogo-C基因rs17046518 G/A多態(tài)性研究不僅有利于認(rèn)識臨床與Nogo-C基因相關(guān)的多種疾病在不同種族和地域表現(xiàn)出來的差異，而且為進(jìn)一步人類學(xué)及群體遺傳學(xué)的研究和基因多態(tài)性普查奠定了基礎(chǔ)，并為進(jìn)行疾病前瞻性研究提供了重要的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

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