龐龍濱,賀韋東,邢春燕,張 萍,陳 敏
(1濟南市中心醫(yī)院,濟南250014;2山東省血液中心)
促凋亡蛋白(BIM)是Bcl-2家族中僅含一個BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白,具有促凋亡活性,廣泛分布于機體各種組織,對防御自身免疫、維持造血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要意義,并有腫瘤抑制因子活性[1~3]。2011年6~10月,我們觀察了吉非替尼干預(yù)及BIM重組腺病毒轉(zhuǎn)染對表皮生長因子受體(EGFR)基因突變H3255肺腺癌細(xì)胞株(以下簡稱H3255)凋亡及BIM表達的影響,現(xiàn)報告如下。
1.1 材料 H3255(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)。RPMI1640、FBS(Gibco公司)。SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Annexin PI單染凋亡檢測試劑盒(江蘇碧云天公司)。一抗BIM抗體(H-191,兔抗人,Santa Cruz公司),抗 Actin抗體(TA-09,鼠抗人,北京中杉金橋公司)。二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋公司)。DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(中杉金橋公司),BIM重組腺病毒(吉凱公司),吉非替尼[英國阿斯利康公司,將吉非替尼250 mg溶于二甲基亞砜(DMSO)中配成工作濃度0.01 mmol/L,分裝于EP管,-80℃保存]。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將H3255置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液的25 cm2培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達80%以上時行0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞,將其隨機分為5組,吉非替尼組將H3255按1×106/L濃度接種于24孔板培養(yǎng)過夜,然后加入1μmol/L吉非替尼培養(yǎng)48 h;DMSO對照組僅加入0.1%DMSO培養(yǎng)48 h;轉(zhuǎn)染組以BIM重組腺病毒轉(zhuǎn)染,陰性對照組以不帶BIM的空載體轉(zhuǎn)染,空白對照組不轉(zhuǎn)染,將相應(yīng)的腺病毒量分別按200、200、0感染復(fù)數(shù)(MOI)加入到接種好的細(xì)胞中混勻,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6 h后更換含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。
1.3 觀察項目
1.3.1 細(xì)胞凋亡率 采用Annexin PI單染法。將上述各組貼壁細(xì)胞用酶消化后制成單細(xì)胞懸液,用PBS洗滌1次,低速離心棄上清,加入預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為70%,4℃避光過夜。離心去固定液,PBS洗滌1次,低速離心棄上清,每孔加1 mL的PI染液,4℃避光30 min后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組實驗重復(fù)3次。
1.3.2 BIM蛋白表達 采用Western blot法。將上述各組貼壁細(xì)胞用預(yù)冷 PBS洗1次,加1×(含SDS)Loading buffer裂解細(xì)胞,用軟刮子將細(xì)胞刮下來,并轉(zhuǎn)移至EP管,保持在冰上剪切DNA 10~15 s,降低樣本黏滯度。95~100℃加熱10 min,冰上冷卻,4℃離心11 000 g×4 min吸取上清至EP管中(此為細(xì)胞總蛋白),-80℃保存。樣品上樣量均20μL,于SDS-PAGE凝膠4℃ 90 V電壓電泳2~2.5 h,于4℃穩(wěn)流50 mA轉(zhuǎn)膜12~14 h后,用5%W/V脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗3次。將目的蛋白和內(nèi)參的膜剪開,分別加兔抗人BIM抗體(1∶500)和鼠抗人Actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,TBST洗3次。分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h,TBST洗3次。用DAB辣根過氧化物酶顯色方法顯色,掃描圖像保存。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件,計量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,采用單因素方差分析及t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 細(xì)胞凋亡率 吉非替尼組、DMSO對照組、轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、空白對照組細(xì)胞凋亡率分別為(58.04 ± 3.15)%、(12.30 ± 2.96)%、(51.43 ±12.73)%、(12.73 ±2.40)%、(8.77 ± 1.52)%,吉非替尼組與DMSO對照組比較及轉(zhuǎn)染組與陰性對照組、空白對照組比較,P均<0.01,而吉非替尼組與轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2 BIM蛋白表達 與DMSO對照組比較,吉非替尼組BIM蛋白表達水平明顯增高,見圖1A。與陰性對照組、空白對照組比較,轉(zhuǎn)染組BIM蛋白表達顯著增高,見圖1B。
圖1 H3255細(xì)胞株BIM蛋白表達
近年來肺癌發(fā)病率逐年上升,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80% ~85%[4];靶向治療是肺癌治療的一種新方法,且近年來取得較大進展,可明顯提高患者的5年生存率。吉非替尼為NSCLC靶向治療的代表性藥物,是信號傳導(dǎo)通路酪氨酸激酶抑制劑。以腺病毒為載體的基因治療亦為目前研究的熱點。國內(nèi)外多項研究表明BIM在腫瘤細(xì)胞凋亡中伴有重要角色,有望成為腫瘤靶向治療的新靶點。BIM為促細(xì)胞凋亡蛋白多肽,是Bcl-2家族成員,僅具有一個BH3結(jié)構(gòu)域,可通過拮抗抗凋亡因子的作用或直接與Bax等相互作用并共同轉(zhuǎn)位到線粒體膜上引起細(xì)胞色素C釋放而誘導(dǎo)凋亡。BIM(BIM-EL)在人類基因組中位于2q12-q13,含有6個外顯子,第三個外顯子被選擇性剪切掉后其mRNA將被翻譯成BIM 較短的兩個存在形式 BIML和 BIMS[5]。Costa等[6]研究證實,對吉非替尼等靶向治療藥物有效的肺癌患者,其癌細(xì)胞內(nèi)BIM表達數(shù)量顯著增加,而BIM基因敲除后可使原來敏感的腫瘤細(xì)胞對靶向藥物耐藥,說明BIM在靶向治療藥物介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
有研究認(rèn)為不同EGFR突變株對吉非替尼的敏感性不同,H3255存在第21外顯子2 573氨基酸位的 T→G(L858R)[7]。Kobayashi等[8]研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼誘導(dǎo)EGFR-L858R突變株凋亡的能力明顯高于-L858R-T790M突變株。本研究首先采用吉非替尼作用于EGFR突變的H3255,發(fā)現(xiàn)吉非替尼能誘導(dǎo)H3255凋亡,且H3255表達BIM-EL亦明顯增高。之后我們將重組腺病毒BIM轉(zhuǎn)染至H3255腫瘤細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染的H3255相比,BIM蛋白表達增高,且細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增高。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BIM重組腺病毒轉(zhuǎn)染和吉非替尼藥物干預(yù)的促凋亡率相近,因此我們認(rèn)為通過此種分子生物學(xué)方法亦可直接促使H3255細(xì)胞內(nèi)的BIM過表達并促進H3255細(xì)胞凋亡,且與吉非替尼藥物干預(yù)的效果相同。
綜上所述,吉非替尼與BIM重組腺病毒均可促使H3255細(xì)胞突變株(L858R)BIM呈高表達,并促進H3255細(xì)胞凋亡,且二者凋亡率相近,推測吉非替尼對存在EGFR突變的NSCLC細(xì)胞株的促凋亡作用機制可能與增強BIM表達有關(guān)。
[1]Strasser A,Puthalakath H,Bouillet P,et al.The role of Bim,aproapoptotic BH3-only member of the Bcl-2 family in cell-death control[J].Ann NY Acad Sci,2000,917(1):541-558.
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[3]Desbien AL,Kappler JW,Marrack P.The Epstein-Barr virus Bcl-2 homolog,BHRF1,blocks apoptosis by binding to a limited amount of Bim[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(14):5663-5668.
[4]王聰慧,陸友金.非小細(xì)胞肺癌中TMSl基因甲基化檢測[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,43(1):46-49.
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