siRNA干擾沉默EZH2基因?qū)θ烁伟〩epG2細(xì)胞增殖的影響

龐玉艷，馮震博，李 佳，危丹明

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)是果蠅Zeste基因增強(qiáng)子的人類同源基因，為Polycomb group(PcG)基因家族的重要成員之一。PcG是進(jìn)化過程中保守的染色質(zhì)修飾基因，在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［1］，EZH2為其核心成分，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，多項(xiàng)研究顯示其過量表達(dá)與結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)［2～4］。抑制沉默EZH2基因表達(dá)可能成為一種潛在的基因治療新方法。2011年3～7月，我們以小分子RNA(siRNA)干擾技術(shù)通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，沉默靶基因EZH2，在細(xì)胞和蛋白水平上觀察siRNA對(duì)EZH2基因表達(dá)的影響，旨在為肝癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細(xì)胞株、流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM均購自KeyGEN，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料所，MTT試劑盒、細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(Bryotime)，Lipofectamine2000、TRizol試劑(Invitrogen)，ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit及SyBR Green Real Time PCR Master MIX購自日本東洋紡(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司。兔抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人EZH2多克隆抗體(Epitomics公司)，EZH2 siRNA、Negative control FAM(N.C-FAM)均由上海吉瑪公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將HepG2細(xì)胞株置于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞按照每孔(0.5～1.0)×104/mL細(xì)胞濃度接種96孔板及每孔(1.0～1.5)×105/mL細(xì)胞濃度接種6孔板，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞融合率為30%～50%。將細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組按照 Lipofectamine2000使用說明分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 EZH2 siRNA(序列為 5'-GGGAAAGUGUAUGAUAAAUTT-3')、FAM(序列為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h在熒光顯微鏡下可看到少許綠色熒光，48 h綠色熒光明顯即轉(zhuǎn)染成功?？瞻讓?duì)照組不予任何干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染后第24、48、72和96小時(shí)分別進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入10μL MTT溶液(5 mg/mL)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后小心棄上清且加入DMSO溶解紫色結(jié)晶。用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染后48 h收集濃度1.0×106/mL單細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞1次，每管加入100μL Rnase A 37℃水浴30 min，再加入400μL PI染色混勻，4℃避光30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析各組細(xì)胞周期時(shí)相分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染后48h用PBS洗滌細(xì)胞2次，離心2000r/min，5min，收集(1～5)×105/mL細(xì)胞，每管加入300μLBindingBuffer懸浮細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC混勻，加入5μL的PropidiumIodide，混勻，室溫，避光，反應(yīng)15min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)段癌細(xì)胞凋亡分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 EZH2mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48h后抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系體積20μL，內(nèi)含1 μg總RNA、5×RT緩沖液4μL、dNTPMixture(各10 μmol/L)2μL、RNA 酶抑制劑1 μL、Oligo(dT)(10 pmol/μL)1μL和逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，其余以DEPC水補(bǔ)足;混勻后短暫離心，42℃ 60min，95℃ 10min逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以各組cDNA作為模板，于熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRealtime-PCR，根據(jù)相對(duì)定量2－△△Ct方法計(jì)算各組EZH2mRNA表達(dá)水平的相對(duì)比值。1.3.5 EZH2蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)48h后的各組細(xì)胞，抽提總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以每泳道20μg濃度的蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，經(jīng)過封閉、一抗(兔抗人EZH2多克隆抗體1∶1000)孵育過夜、PBST洗膜、HRP標(biāo)記鼠抗兔二抗(1∶5000)，室溫1h，PBST洗膜等步驟后，曝光掃描圖片。以β-actin作為內(nèi)參照分析與EZH2條帶灰度值的比值，檢測(cè)EZH2蛋白表達(dá)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染組于48h出現(xiàn)細(xì)胞增殖活性受抑，72、96h抑制作用逐漸明顯(圖1)，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，P均＜0.01;陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖活性比較均無明顯差異。未觀察到各組細(xì)胞明顯形態(tài)學(xué)改變。

圖1 各組細(xì)胞增殖活性

2.2 細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48h后轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞數(shù)為(77.7±4.3)%，S 期細(xì)胞數(shù)(12.25 ±1.2)%，陰性對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞數(shù)為(64.89±3.5)%，S期細(xì)胞數(shù)(23.13±2.7)%，而空白對(duì)照組G0/G1期為(63.52 ±3.5)%，S 期為(24.09 ±3.2)%，轉(zhuǎn)染組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)明顯增少，P均＜0.01，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞周期比較無明顯差異。

2.3 細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48h后轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組凋亡率分別為(43.97±4.1)%、(22.03 ±1.3)%、(24.05 ±2.7)%，轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，P均＜0.01;陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無明顯差異。

2.4 EZH2mRNA和蛋白表達(dá) HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組EZH2 mRNA 表達(dá)水平分別為 0.98 ±0.03、1.44 ±0.30、2.11±0.35(圖2)，轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，P均＜0.01;轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組EZH2蛋白表達(dá)水平分別為0.35±0.12、0.90 ±0.27、0.95 ±0.30(圖 3)，轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，P均＜0.05，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組EZH2mRNA和蛋白表達(dá)比較均無明顯差異。

圖2 各組細(xì)胞EZH2mRNA表達(dá)

圖3 各組細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)

3 討論

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)指由非編碼小分子 RNA(siRNA、microRNA)誘導(dǎo)的、通過靶向沉默基因mRNA正常表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的分裂行為，長(zhǎng)度為21～24nt，經(jīng)RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)催化形成RNA沉默復(fù)合物(RISCs)，并與靶基因mRNA堿基互補(bǔ)相結(jié)合，影響靶基因的翻譯［5］。Cao等［6］認(rèn)為 EZH2 作為 PcG 基因家族的核心成員，依賴EZH2蛋白完整的SET結(jié)構(gòu)域?qū)诵◇w組蛋白H3的27位賴氨酸進(jìn)行甲基化修飾形成二甲基或三甲基(H3K27me2/me3)而發(fā)揮沉默下游目的抑癌基因如 E-cadherin、p16INK4α等的作用［7，8］。針對(duì) EZH2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用，目前研究已顯示在膀胱癌、胃癌等腫瘤中利用RNAi技術(shù)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲力［9，10］，并發(fā)現(xiàn)EZH2在不同腫瘤細(xì)胞中的促增殖能力可能存在差異。

已有研究顯示EZH2在肝癌(HCC)組織中較癌旁及正常肝組織中表達(dá)明顯增高［9］，本實(shí)驗(yàn)將EZH2 siRNA成功轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞內(nèi)沉默EZH2基因表達(dá)，結(jié)果顯示隨時(shí)間推移，肝癌細(xì)胞增殖呈明顯抑制趨勢(shì)，抑制效應(yīng)于轉(zhuǎn)染后48 h顯現(xiàn)，并持續(xù)48 h以上，且細(xì)胞周期發(fā)生改變，多數(shù)細(xì)胞停滯于G0/G1期，細(xì)胞增殖活性下降，誘導(dǎo)凋亡增加;EZH2 mRNA和蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì)，證實(shí)EZH2 siRNA具有抑制肝癌細(xì)胞中EZH2基因表達(dá)的作用。可見RNAi技術(shù)可成功干擾肝癌細(xì)胞株HepG2中EZH2表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期的調(diào)控失衡為腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，是多基因突變、多環(huán)節(jié)失控的結(jié)果。G1/S期過渡階段是細(xì)胞周期中較敏感的時(shí)期，易受外界因素的影響而發(fā)生異常，而pRB/E2F調(diào)節(jié)通路恰處于G1/S期調(diào)控的核心位置。在細(xì)胞周期G1期的早中期，去磷酸化的pRB結(jié)合于E2F的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，從而阻止了靶基因的轉(zhuǎn)錄;而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1后期時(shí)，去磷酸化的pRB被cyclinD/cdk4/cdk6催化并磷酸化，pRB磷酸化而釋放出E2F，激活靶基因和細(xì)胞周期進(jìn)程所需的諸多基因的轉(zhuǎn)錄［11］。EZH2的編碼產(chǎn)物屬于Polycomb抑制復(fù)合體2(PRC2/3/4)的成員，是轉(zhuǎn)錄因子E2F的靶基因［12］。E2F與 EZH2的啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致EZH2高表達(dá)，并通過EZH2對(duì)核小體組蛋白H3的27位賴氨酸進(jìn)行甲基化修飾，發(fā)揮沉默下游抑癌基因的作用，最終引起細(xì)胞周期調(diào)控失衡，促進(jìn)細(xì)胞無規(guī)律增殖。因此，利用EZH2 siRNA沉默靶基因EZH2表達(dá)，抑制EZH2對(duì)下游抑癌基因的沉默作用，可影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。

綜上所述，EZH2在肝癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，利用siRNA技術(shù)可抑制EZH2表達(dá)，從而抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖，此對(duì)腫瘤診斷、基因治療有重要意義。

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