類胚體形成對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響

尹 青，陳 煒，李 莉，謝丹丹，龔 淼

(河北醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，石家莊050017)

P19細(xì)胞是一種具有胚胎干細(xì)胞特性的小鼠畸胎瘤細(xì)胞系，其在體外單層培養(yǎng)條件下多次傳代可保持干細(xì)胞特性，條件培養(yǎng)可分化為包括心肌細(xì)胞［1～3］在內(nèi)的多種細(xì)胞。P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及電生理學(xué)特征基本模擬了正常小鼠心肌發(fā)育過程［4］，且易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染，是研究心肌細(xì)胞發(fā)育及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的理想體外細(xì)胞系統(tǒng)。2010年5月～2011年2月，我們應(yīng)用心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)P19細(xì)胞及P19細(xì)胞類胚體(EBs)并觀察了P19細(xì)胞的生長、分化狀態(tài)，旨在探討心肌環(huán)境因素及EBs形成對細(xì)胞分化的作用及心肌細(xì)胞的分化機(jī)制，為胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 新生1～3 d的SD大鼠，雌雄不限(河北省實(shí)驗(yàn)動物中心)。小鼠 P19細(xì)胞系(ATCC，CRL-1825，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心)。α-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。心肌肌鈣蛋白T(cTnT)單克隆抗體(英國Abcam公司)，心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)單克隆抗體(美國 Invitrogen公司)。

1.2 P19細(xì)胞聚集培養(yǎng) 取復(fù)蘇傳代4代以上P19細(xì)胞，以0.25×106/mL密度接種于鋪有0.5%軟瓊脂［5］的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d半量換液，誘導(dǎo)4 d形成EBs或細(xì)胞聚集體。

1.3 心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液制備 將新生SD大鼠心室組織剪成1 mm3大小的碎塊，加入3倍稀釋的0.25%胰酶與0.02%EDTA的混合液，37℃重復(fù)消化心肌組織，200目尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 r/min離心。取細(xì)胞沉淀制成單細(xì)胞懸液，差速貼壁法純化心肌細(xì)胞。將心肌細(xì)胞以4×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，每日收集培養(yǎng)液，離心，取上清液與α-MEM培養(yǎng)液1∶1混合，制備心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液。

1.4 P19細(xì)胞分化誘導(dǎo) 將P19細(xì)胞隨機(jī)分為四組，對照組將P19細(xì)胞以0.25×106/mL密度接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng);條件液培養(yǎng)組將P19細(xì)胞以0.25×106/mL密度接種于6孔板中，用心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng);EBs組將P19細(xì)胞EBs接種于6孔板中，用 α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。EBs+條件培養(yǎng)液組將P19細(xì)胞EBs接種于6孔板中，用心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.5 cTnT及Cx43表達(dá)檢測 ①免疫組化SP法:取各組培養(yǎng)7、10 d時的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后，按SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色［5］，觀察 cTnT表達(dá)。②Western blot法:收集各組培養(yǎng)7、10 d時細(xì)胞，提取總蛋白。定量后的蛋白各取80μg，PVDF膜轉(zhuǎn)移后用脫脂奶粉封閉。一抗分別為cTnT(1∶1 000)，Cx43(1∶400)，4 ℃過夜。ECL 試劑盒檢測免疫活性蛋白。以β-actin作為內(nèi)參，用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有計(jì)量數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，各組比較采用單因素方差分析或配對t檢驗(yàn)，當(dāng)方差分析有顯著性差異時進(jìn)一步用q檢驗(yàn)做兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞生長狀態(tài) 倒置相差顯微鏡下可見心肌細(xì)胞貼壁后細(xì)胞逐漸伸出突起，細(xì)胞核圓形，體積較大，培養(yǎng)2～3d后細(xì)胞伸出突起交織成網(wǎng)，細(xì)胞同步搏動，頻率多為60～120次/min。對照組與條件液培養(yǎng)組P19細(xì)胞貼壁生長，增殖速度較快，細(xì)胞大量堆積，出現(xiàn)接觸性死亡。EBs組與EBs+條件培養(yǎng)液組EBs黏附生長，EBs中央聚集細(xì)胞壞死，形成壞死區(qū)，細(xì)胞由EBs邊緣爬出，在EBs周圍形成生長暈，部分細(xì)胞體積增大，呈梭形或桿狀且彼此相連。各組均未觀察到跳動細(xì)胞。

2.2 cTnT及Cx43表達(dá) 免疫組化SP法檢測示對照組與條件液培養(yǎng)組未見cTnT陽性細(xì)胞。EBs組與EBs+條件培養(yǎng)液組在EBs周圍可見cTnT陽性細(xì)胞，EBs+條件培養(yǎng)液組陽性細(xì)胞數(shù)多于EBs組，散在或聚集分布于EBs周圍的生長暈中，隨培養(yǎng)時間延長，陽性細(xì)胞數(shù)有增多趨勢。Westernblot法檢測結(jié)果示對照組與條件液培養(yǎng)組未發(fā)現(xiàn)cTnT和Cx43表達(dá)。培養(yǎng)7、10d時EBs+條件培養(yǎng)液組cT-nT和Cx43表達(dá)均明顯高于EBs組(P均＜0.05，圖1，圖2)。EBs+條件培養(yǎng)液組cTnT和Cx43表達(dá)第10天時顯著高于第7天(P均＜0.01，圖1，圖2)。

3 討論

心肌細(xì)胞不可逆性壞死、功能性細(xì)胞數(shù)量下降等所致的心力衰竭是心血管疾病患者的主要死亡原因之一。近年來對干細(xì)胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植治療可取代受損心肌細(xì)胞并重建血運(yùn)。但干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的機(jī)制尚不清楚，如何有效誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化是亟待解決的問題。

圖1 兩組cTnT表達(dá)

圖2 兩組Cx43表達(dá)

P19細(xì)胞是從小鼠畸胎瘤中分離得到的具有胚胎干細(xì)胞特性的胚胎畸瘤細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞在分化潛能、超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性，由于其在心肌細(xì)胞發(fā)育過程中與小鼠胚胎干細(xì)胞有相似的特性，故常被作為研究心肌細(xì)胞早期分化的模型系統(tǒng)［4］。以往的研究中多應(yīng)用化學(xué)試劑(二甲基亞砜、視磺酸、5-氮胞苷等)誘導(dǎo)P19細(xì)胞的分化，但化學(xué)誘導(dǎo)劑具有一定毒性，限制了其應(yīng)用。目前認(rèn)為，心臟微環(huán)境對于干細(xì)胞的分化具有重要的誘導(dǎo)作用，但心臟環(huán)境較為復(fù)雜，具體何種因素影響干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化目前尚不清楚。

cTnT為細(xì)胞骨架蛋白，只在心肌細(xì)胞特異性表達(dá);Cx43是心肌細(xì)胞間的主要連接蛋白，心肌細(xì)胞間電信號的傳導(dǎo)有賴于Cx43結(jié)構(gòu)和功能的完整性，二者均是鑒定心肌細(xì)胞分化的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，P19細(xì)胞在心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)條件下無cTnT、Cx43表達(dá)，表明單純的心肌細(xì)胞外環(huán)境不能刺激誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。Rangappa 等［6～8］研究發(fā)現(xiàn)，條件培養(yǎng)或間接接觸共培養(yǎng)條件下培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性基因表達(dá)。由此可見，心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等心臟組織細(xì)胞的分泌物不足以誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，或許與所選用細(xì)胞與細(xì)胞所處心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液的濃度、生長發(fā)育時間有關(guān)。

EBs作為胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型，在誘導(dǎo)細(xì)胞分化的研究中廣泛應(yīng)用［9］。在胚胎發(fā)育和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［10～12］，內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞條件培養(yǎng)及直接接觸培養(yǎng)均可誘導(dǎo)ESCs向心肌細(xì)胞分化。中胚層向終末心肌細(xì)胞的分化過程中受到中胚層，特別是內(nèi)胚層的信號誘導(dǎo)及基因調(diào)控。在細(xì)胞聚集體形成過程中心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4表達(dá)量增加，可促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。我們的研究顯示，EBs在自然培養(yǎng)條件下，部分細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異cTnT，而單層培養(yǎng)P19細(xì)胞無心肌細(xì)胞分化，表明EBs或細(xì)胞聚集體的形成或許模擬了早期胚層形成過程，對于促進(jìn)心肌細(xì)胞分化具有重要作用;而EBs形成結(jié)合心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后心肌細(xì)胞cTnT及Cx43表達(dá)明顯高于EBs自然培養(yǎng)，表明心臟組織液可促進(jìn)P19心肌細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)中均未觀察到跳動細(xì)胞，可能與細(xì)胞誘導(dǎo)時間及分化細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。

總之，EBs形成結(jié)合心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)可有效促進(jìn)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，具體分化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。而干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化是一極其復(fù)雜的過程，如何誘導(dǎo)分離大量的心肌細(xì)胞用于細(xì)胞移植治療仍需深入研究。

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