清開靈注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

趙麗紅 卜麗梅 于艷華 李瓊書 石 卓 (吉林大學白求恩醫(yī)學院，吉林 長春 30000)

氧自由基(OFR)對組織細胞的損害是引起再灌注損傷的重要因素之一〔1〕，藥物預處理對缺血再灌注(I/R)損傷心肌的保護亦成為目前的研究熱點。清開靈(QKL)注射液為傳統(tǒng)中藥制劑，對腦I/R損傷具有保護作用〔2〕，但對心肌I/R損傷是否有作用未見報道。本實驗通過觀察麻醉開胸大鼠心肌I/R損傷模型心肌形態(tài)學、血清酶學及抗自由基等指標的變化，探討QKL注射液對心肌I/R損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性Wistar大白鼠，清潔級，體重250～280 g，吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供。QKL注射液由北京中藥廠出品;乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酸(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、氧化氮(NO)試劑盒均由南京建成生物工程技術公司提供。COBAS-FARA型自動生化分析儀(瑞士)，HX-200小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，ECG-6511心電圖機(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型制備 取Wistar雄性大鼠40只，體重250～280 g，隨機均分四組，每組10只。20%烏拉坦(0.5 ml/100 g)麻醉，仰臥位固定，頸部正中分離氣管行氣管插管，開胸后接呼吸機。小動物呼吸機設定潮氣量為5 ml/100 g、呼吸頻率為68次/min，吸呼比為2∶1，根據(jù)呼吸頻率及深度調(diào)整呼吸參數(shù)。沿胸骨左緣做縱向切口，在3～4肋間開胸，暴露心臟，在左冠狀動脈前降支距左心耳下緣1.5～2 mm處穿線，15 min后取心電圖正常者隨機分組，每組10只，即假手術組、模型組、QKL注射液高劑量組(40 mg/kg)及低劑量組(20 mg/kg)。假手術組:冠狀動脈下穿線不結扎。模型組:結扎左冠狀動脈前降支，以心電圖ST段明顯抬高并與QRS波融合為成功標志。QKL注射液高劑量組:舌下靜脈給藥40 mg/kg，15 min后結扎左冠狀動脈前降支。QKL注射液低劑量組:舌下靜脈給藥20 mg/kg，15 min后結扎左冠狀動脈前降支。以上各結扎組缺血40 min后，均打開結扎線形成再灌注2 h。

1.2.2 檢測大鼠血清LDH、CK、AST、SOD、MDA及NO含量上述實驗結束后，由腹主動脈取血5 ml置于玻璃試管中，并立即離心(4℃，3000 r/min，10 min)分離血清，按 LDH、CK、AST、SOD、MDA及NO試劑盒說明書操作，采用自動生化測定儀，在340 nm處檢測血清LDH、CK、AST、SOD、MDA及 NO含量。

1.2.3 檢測并計算大鼠心肌損傷范圍 腹主動脈采血后，迅速剪下心臟，橫向?qū)⑿呐K切5～6片，每片厚約1.5～2 mm，放入1%氯化三苯基四氮(TTC)磷酸緩沖液(pH7.4)，37℃水浴10 min，損傷的心肌細胞因細胞膜損傷脫氫酶釋放丟失，因而不被染色;正常心肌含有脫氫酶可被染為紅色。應用BI2000軟件處理系統(tǒng)計算各部分面積，以各片非染色區(qū)面積之和與各片室壁面積之和的百分比反映心肌損傷范圍。

1.2.4 免疫組化法檢測大鼠心肌誘導型NO合酶(iNOS)的表達 取心尖缺血梗死區(qū)橫切2 mm厚心肌，以磷酸鹽緩沖液(PBS)配成10%甲醛溶液固定，以鏈霉菌素-生物素免疫組化(SP)法觀察心肌細胞iNOS表達。操作步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;(2)3%H2O2常溫下孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸洗5 min;(3)加山羊血清封閉液，室溫15 min清除背景非特異性染色;(4)滴加兔抗鼠iNOS抗體37℃孵育1 h;(5)滴加生物素標記羊抗兔IgG，37℃孵育30 min;(6)加辣根酶標記鏈霉素卵白素，37℃孵育30 min;(7)上述(3)、(4)、(5)后均以 PBS洗3 min×3次;(8)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，封片。陰性對照以PBS代替一抗進行孵育，其他步驟同上。陽性反應:細胞質(zhì)呈棕褐色為iNOS蛋白陽性表達。Image-pro軟件分析計算各組陽性表達細胞的光密度值。

2 結果

2.1 QKL注射液對大鼠血清CK、LDH、AST、SOD、MDA及NO含量的影響 與假手術組

比較，模型組血清CK、LDH及AST活性明顯升高(P＜0.01);與模型組相比，QKL能降低血清CK、LDH及AST的活性(P＜0.05)。與假手術組比較，模型組大鼠血清中 SOD活性降低，NO、MDA含量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，QKL各組大鼠血清中SOD活性明顯升高(P＜0.01)，MDA含量和NO含量明顯降低(P＜0.01)。見表 1，表 2。

表1 QKL注射液對大鼠血清CK、LDH及AST的影響(n=10， ± s，U/L)

表1 QKL注射液對大鼠血清CK、LDH及AST的影響(n=10， ± s，U/L)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

328.12±159.4 330.3±64.2 104.4±40.6模型組 1230.4±213.51)1193.0±223.11)436.0±106.41)QKL高劑量組 886.3±97.81)2)894.25±280.31)2)294.7±67.51)2)QKL低劑量組 857.9±118.31)2)776.9±312.41)2)304.1±66.61)2)CK LDH AST假手術組組別

±s)表2QKL注射液對大鼠血清SOD、MDA及NO的影響(n=10，

±s)表2QKL注射液對大鼠血清SOD、MDA及NO的影響(n=10，

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 SOD(U/ml) MDA(μmol/L) NO(μmol/L)168.04±4.58 5.40±0.86 12.45±2.16模型組 106.22±5.921) 10.92±1.121) 25.3±8.11)QKL高劑量組 135.31±9.321)2)6.98±1.131)2) 16.2±3.01)2)QKL低劑量組 131.56±8.661)2)7.94±0.951)2) 17.7±4.81)2)假手術組

2.2 QKL注射液對心肌損傷范圍的影響 與假手術組比較，模型組心肌梗死面積(MIS)〔(42.30±2.5)%〕明顯增大(P＜0.01)，表明大鼠心肌I/R模型建立成功。與模型組相比，QKL(40 mg/kg)組及 QKL(20 mg/kg)組均能明顯縮小 MIS〔(32.16±3.8)%，(31.43±4.6)%，P ＜0.05〕。

2.3 QKL對iNOS的影響 鏡下可見iNOS主要在胞質(zhì)中表達，陽性細胞被染成棕黃色。I/R后各組心臟心肌均出現(xiàn)iNOS表達增強，模型組iNOS染色陽性細胞數(shù)(92.33±11.34)高于假手術組(40.15±5.69，P＜0.01)，而 QKL高、低劑量組(73.92±14.29，76.76±12.45)與模型組比較陽性細胞數(shù)減少(P＜0.01)，胞質(zhì)表達的棕黃顆粒明顯減少。

3 討論

本研究采用人工結扎大鼠冠脈左前降支制備心肌急性心肌I/R損傷模型，急性心肌梗死后，各項心功能改變及其恢復程度和速度均與MIS呈負相關，故縮小MIS為抗心肌缺血藥物的主要療效指標。此外，心肌發(fā)生缺血壞死，其生理功能、生化代謝方面也隨之發(fā)生相應變化。一般認為，阻斷冠脈血流20～30 min內(nèi)重新供血，心肌病變可以逆轉(zhuǎn)，但長時間缺血缺氧會導致心肌組織細胞損傷，使廣泛存在于心肌組織細胞內(nèi)的CK和LDH釋放出來并擴散入血，血清CK、LDH活性顯著升高，其升高程度與心肌梗死程度相平行。因此，血清CK、LDH水平是心肌損傷的靈敏指標〔3〕。本研究證明，QKL能降低心肌缺血大鼠血清CK和LDH活力，表明其可減輕細胞損傷，并且與其縮小MIS的結果一致。

心肌組織I/R后，細胞膜脂質(zhì)微環(huán)境發(fā)生紊亂，自由基大量產(chǎn)生及自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用增強，同時自由基生成和自由基消除之間的平衡被破壞，自由基嚴重增多，自由基清除劑SOD減少，而活性很強的OFR與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，其過氧化產(chǎn)物MDA對膜有很強的破壞作用，可破壞心肌細胞膜的完整性，改變心肌超微結構，從而加劇心肌缺血，導致心肌細胞損傷〔4〕。檢測MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細胞損傷的程度。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它們是OFR的特異性降解酶，該酶能清除OFR保護細胞免受損傷，其活力的高低間接反映了機體清除OFR的能力。心肌缺血再灌注損傷時早期主要表現(xiàn)為心肌酶漏出。其中血清CK以靈敏度高、特異性強、發(fā)生變化時間早、持續(xù)時間長的特點而經(jīng)常作為首選酶，臨床常把CK作為診斷心肌梗死和判斷其梗死程度的指標之一〔5〕。本實驗結果顯示，QKL能升高結扎冠脈引起的急性心肌缺血大鼠血清中LDH的含量，減少MIS，表明QKL能增強機體對OFR的清除能力，減少細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，維持膜結構的完整性，抑制細胞內(nèi)CK外漏，從而對心肌細胞膜起到保護作用，減少LDH的釋出，縮小MIS。

過量的NO能與超氧自由基或O2形成過氧亞硝酸根離子(ONOO－)和羥自由基(OH)，損傷線粒體膜，使線粒體形成瘺道，開放線粒體轉(zhuǎn)換孔，致使離子平衡紊亂，大量的Na+和Cl－進入細胞內(nèi)，導致細胞內(nèi)水增加引起細胞腫脹，ATP能量合成終止，導致細胞壞死和凋亡〔6〕。NO的毒性作用還表現(xiàn)在通過產(chǎn)生大量的OH－和二氧化氮自由基，直接造成蛋白質(zhì)、核酸、膜脂質(zhì)的損傷，抑制各種與線粒體電子傳遞有關的酶類，從而抑制線粒體呼吸鏈的功能〔7〕，最終導致細胞壞死或凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，假手術組心肌組織iNOS活性增加，提示I/R誘發(fā)iNOS系統(tǒng)功能紊亂，與iNOS活性相關的NO合成增加，將發(fā)揮NO的細胞毒性作用。QKL組預處理后iNOS活性下調(diào)，這可能因為QKL可保護血管內(nèi)皮細胞并逆轉(zhuǎn)NOS系統(tǒng)的功能紊亂，減少再灌注期由iNOS誘導的NO生成，從而抑制ONOO－生成及細胞損傷，對心肌I/R損傷具有一定的保護作用。

1 Misra MK，Sarwat M，Bhakuni P，et al.Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes〔J〕.Med Sci Monit，2009;15(10):209-19.

2 黃真炎，吳玲霓，楊冬娣，等.清開靈對大鼠急性腦缺血超微結構的保護作用〔J〕.中醫(yī)藥研究，1997;13(5):57-8.

3 黃秀蘭，王 偉，周亞偉.淫羊藿總黃酮注射液對大鼠實驗性心肌缺血的保護作用〔J〕.中國中西醫(yī)結合雜志，2006;26(1):68-71.

4 中國醫(yī)學科學院心血管病研究所基礎研究室.血清肌酸激酶在急性心肌梗塞診斷中的價值〔J〕.心血管疾病，1974;2:278.

5 Sawa Y，Bai HZ，Suzuki K，et al.Efficency of in vivo gene transfection into transplanted rat heart by coronary infusion of HVJ liposome〔J〕.Circulation，1995;92(2):772-82.

6 Niwa M，Inao S，Takayasu M，et al.Time course of expression of three nitric oxide synthase isoforms after transient middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕.Neurol Med Chir(Tokyo)，2001;41(2):63-72.

7 Dohi K，Ohtaki H，Inn R，et al.Oeroxynitrite and caspase-3 expression after ischemia/reperfusion in mouse cardiac arrest model〔J〕.Acta Neurochir Suppl，2003;86:87-91.