腦缺血后大鼠腦實(shí)質(zhì)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因Gadd45β蛋白的表達(dá)

李建瑞 李長(zhǎng)清 劉迎梅 劉 彬 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400010)

近年來(lái)有研究表明〔1〕，生長(zhǎng)抑制與DNA損傷修復(fù)基因β(Gadd45β)缺失的大鼠在活動(dòng)誘發(fā)的成熟海馬區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和新生神經(jīng)元的樹突增長(zhǎng)中存在明顯缺陷。Gadd45β可能是參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元回路活化、DNA修飾與成年腦內(nèi)神經(jīng)再生外源性調(diào)節(jié)因子分泌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。但腦缺血性損傷后Gadd45β的表達(dá)變化及其作用不清楚，本研究通過(guò)檢測(cè)在缺血周邊區(qū)Gadd45β蛋白的表達(dá)變化，探討其在腦缺血后促損傷的神經(jīng)元再生和神經(jīng)修復(fù)方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作 健康SD大鼠94只，雄性，鼠齡3個(gè)月左右，體重250～280 g(由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，將94只大鼠隨機(jī)分成正常大鼠組4只、假手術(shù)組30只、腦I/R對(duì)照組30只和腹腔注射PDTC組(PDTC組)30只，除正常組外，各組又分別分成缺血再灌注后6、12、24、48及72 h組5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。腦I/R組和PDTC(四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯)組各大鼠均采用Zea等〔2〕的線栓法，建立大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，缺血2 h后再灌注，腦I/R對(duì)照組各大鼠在再灌注后0.5 h腹腔注射生理鹽水(100 mg/kg)，PDTC組各大鼠缺血再灌注后0.5 h腹腔注射PDTC(100 mg/kg)。以清醒后出現(xiàn)對(duì)側(cè)上肢為重的癱瘓及同側(cè)Homer征為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組除插線1 cm同時(shí)腹腔注射同等劑量的生理鹽水外，其余步驟同PDTC組。正常大鼠不經(jīng)任何處理直接取材檢測(cè)。

1.2 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 參照 Zea Longa〔2〕的5分法進(jìn)行評(píng)分。術(shù)后大鼠清醒時(shí)(多為術(shù)后1.5～3 h)進(jìn)行第一次評(píng)分，術(shù)后24 h、72 h 再次評(píng)分。

1.3 標(biāo)本采集及細(xì)胞學(xué)檢查 試驗(yàn)組動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取材，40 g/L多聚甲醛(4℃)經(jīng)心臟灌注固定，立即取腦自視交叉平面向后冠狀切開制成5 mm厚的組織塊，用4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切片厚4 mm，HE染色，光鏡高倍鏡(400倍)下，隨機(jī)觀察缺血周圍6個(gè)不重疊的視野，每個(gè)視野不少于100個(gè)細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.4 Gadd45β蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化(SABC)法，Gadd45β為兔多克隆抗體(Santa Cruz公司提供)稀釋度為1∶50。按照試劑盒說(shuō)明書操作，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。取缺血后再灌注各組大腦切片如0.01 mol/L PBS代替一抗孵育時(shí)，Gadd45β蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)陰性，表明一抗的特異性較強(qiáng)。

1.5 半定量分析Gadd45β蛋白 采用Western印跡法，在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)處死大鼠，按照凱基全蛋白提取說(shuō)明書提取全蛋白，應(yīng)用Bradford法測(cè)定提取物的蛋白濃度，用12%分離膠行蛋白SDS－PAGE變性電泳，分離含一定量蛋白的全蛋白抽提物，檢測(cè)Gadd45β和β－actin時(shí)每泳道蛋白加樣量均為40 μg。電泳結(jié)束，將蛋白電轉(zhuǎn)印至 PVDF膜;TBS洗膜后，用一抗工作液孵膜，4℃過(guò)夜 (16～18 h);TBST緩沖液洗膜3次，用HRP標(biāo)記二抗工作液孵膜，37℃1 h;洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，圖像處理系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定。以β－actin為 內(nèi) 參 照，一 抗 為 小 鼠 抗 β－actin單 克 隆 抗 體(1∶1000)，二抗為 HRP標(biāo)記羊抗小鼠 IgG(1∶1000)。Western印跡膜片用Chemi Doc－XRS系統(tǒng)掃描，并用 QuantityOne 4.6版圖像分析軟件(Bio－Rad公司產(chǎn)品)測(cè)量Gadd45β蛋白和內(nèi)參照β－actin蛋白各顯色條帶的平均光密度值，以Gadd45β與對(duì)應(yīng)的內(nèi)參照 β－actin蛋白顯色條帶的 OD值的比值標(biāo)示Gadd45β蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 腦I/R組和PDTC組大鼠在術(shù)后清醒時(shí)評(píng)分相近，兩組大鼠在造模術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化趨勢(shì)相同，腹腔注射PDTC后大鼠在術(shù)后24 h，72 h的評(píng)分較腦I/R組高，但第72小時(shí)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分( ± s，n=6)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分( ± s，n=6)

與腦I/R對(duì)照組比較:1)P＜0.05

72 h假手術(shù)組組別 再灌注后清醒 再灌注后24 h 再灌注后0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00腦I/R組 2.83±0.41 2.42±0.49 1.83±0.26 PDTC組 2.82±0.40 2.67±0.41 2.33±0.521)

2.2 各組大鼠腦組織Gadd45β的表達(dá) 正常大鼠可見少許Gadd45β蛋白表達(dá)，位于神經(jīng)元細(xì)胞核，被染成棕黃色，主要見于海馬。假手術(shù)組大鼠腦組織中Gadd45β蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞與正常大鼠比較無(wú)明顯差別。在腦I/R組大鼠Gadd45β蛋白的免疫陽(yáng)性反應(yīng)見于細(xì)胞核，主要在缺血區(qū)皮質(zhì)缺血半暗帶表達(dá)，而缺血中心區(qū)則很少。與假手術(shù)組相比，不同時(shí)間點(diǎn)MCAO大鼠缺血對(duì)側(cè)Gadd45β蛋白的表達(dá)無(wú)顯著增加，在再灌注后6 h缺血側(cè)Gadd45β蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開始增多，12 h進(jìn)一步增多，24 h達(dá)到高峰，之后開始下降，48 h，72 h進(jìn)一步下降但仍高于假手術(shù)組主要見于缺血側(cè)皮層的頂葉區(qū)，在丘腦也有表達(dá)。PDTC組在各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著少于腦I/R組，高于假手術(shù)組，但Gadd45β蛋白表達(dá)與腦I/R組呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)。見圖1，表2。

2.3 半定量檢測(cè)各組大鼠腦組織Gadd45β蛋白表達(dá) 腦I/R組Gadd45β蛋白在缺血再灌注后6 h開始升高，12 h進(jìn)一步增多，24 h達(dá)到高峰，48 h有所下降，72 h進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PDTC組在各時(shí)間點(diǎn)Gadd45β蛋白表達(dá)與腦I/R組呈現(xiàn)相同趨勢(shì)但明顯低于腦I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2，表3。

圖1 各組大鼠Gadd45β表達(dá)(×400)

表2 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Gadd45β蛋白的表達(dá)情況(細(xì)胞數(shù)/視野， ± s，n=6)

表2 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Gadd45β蛋白的表達(dá)情況(細(xì)胞數(shù)/視野， ± s，n=6)

與腦I/R組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01，下表同

72 h腦I/R組 7.50±1.87 13.16±2.14 27.0±2.82 15.83±1.72 1組別 再灌注后6 h 再灌注后12 h 再灌注后24 h 再灌注后48 h 再灌注后0.17±1.72 PDTC組 4.66±1.212) 8.67±1.752) 15.83±2.042) 10.66±1.632) 6.67±1.631)假手術(shù)組 2.16±0.752) 2.33±1.212) 2.50±1.042) 2.33±1.032) 2.16±1.172)

表3 各組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Gadd45β蛋白的表達(dá)(n=6，±s)

表3 各組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Gadd45β蛋白的表達(dá)(n=6，±s)

72 h腦I/R對(duì)照組 0.93±0.017 0.99±0.015 1.10±0.055 0.90±0.033組別 再灌注后6 h 再灌注后12 h 再灌注后24 h 再灌注后48 h 再灌注后0.84±0.017 PDTC組 0.85±0.0212) 0.87±0.0122) 0.91±0.0222) 0.83±0.0101) 0.80±0.0202)

圖2 Western印跡檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Gadd45β蛋白表達(dá)

3 討論

最新研究表明，在缺血后的神經(jīng)元中，可以引起DNA單鏈及雙鏈損傷或斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡〔3，4〕。大量的研究已發(fā)現(xiàn)損傷的DNA可以引起Gadd45的表達(dá)增多。作為DNA損傷及誘導(dǎo)相關(guān)基因 Gadd45，由 Gadd45α、Gadd45β 和Gadd45γ 三種亞型組成〔5〕。

近年來(lái)已有研究表明腦缺血后Gadd45的表達(dá)在促進(jìn)受損的腦組織修復(fù)和抗損傷方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)出生后7日的新生小鼠腦缺血后受損腦組織的中有Gadd45蛋白的大量表達(dá)，推測(cè)Gadd45在對(duì)抗過(guò)氧化物引起的腦組織損傷和促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)中發(fā)揮重要作用〔6〕。Jin等〔7〕發(fā)現(xiàn)，局限性腦缺血4h后的大鼠，在其缺血的皮層開始出現(xiàn)Gadd45 mRNA的表達(dá)，而在缺血24 h后則主要表達(dá)在缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)。本文發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后6 h時(shí)Gadd45β蛋白開始增多，24 h達(dá)到高峰，之后開始下降，但72 h仍高于假手術(shù)組，提示腦缺血可誘導(dǎo)持續(xù)達(dá)72 h以上的Gadd45β蛋白表達(dá)增加。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，PDTC組的大鼠在腹腔注射四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯后，大鼠缺血腦組織Gadd45β蛋白表達(dá)增加受到明顯抑制，提示四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯可抑制腦缺血誘導(dǎo)的Gadd45β表達(dá)。四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯為NF－κB的抑制劑。Jin等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)在外界壓力和細(xì)胞因子的刺激下NF－κB的亞單位RelA可以激活Gadd45β的表達(dá)。由以上研究提示腦缺血誘導(dǎo)的Gadd45β表達(dá)可能受到NF－κB信號(hào)通路活動(dòng)的調(diào)控。

Bin等〔9〕研究認(rèn)為Gadd45β對(duì)受到氧化應(yīng)激和化學(xué)藥物的刺激發(fā)生損傷和變性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用，有抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性的作用。Gadd45β不僅對(duì)大鼠受損神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用而且可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其他受損神經(jīng)元也有保護(hù)作用。腦缺血誘導(dǎo)的Gadd45β表達(dá)主要在缺血區(qū)皮質(zhì)缺血半暗帶，而缺血中心區(qū)則很少。已有大量研究表明腦缺血后存在氧化應(yīng)激，Ca內(nèi)流等引起的神經(jīng)元的損傷。由此提示Gadd45β對(duì)腦缺血后氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)元也有可能有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)受損神經(jīng)元修復(fù)的作用。我們通過(guò)對(duì)造模術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，與腦I/R組比較PDTC組大鼠造模術(shù)后肢體活動(dòng)恢復(fù)受到明顯的抑制，證明抑制了Gadd45β的表達(dá)不利于癱瘓肢體的恢復(fù)，進(jìn)一步說(shuō)明Gadd45β有神經(jīng)康復(fù)作用。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后可以引起B(yǎng)DNF和FGF－1等外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和分泌增加。已有大量研究表明在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、成熟過(guò)程中維持神經(jīng)元功能和神經(jīng)元損傷后的再生修復(fù)和防止神經(jīng)細(xì)胞退行性變等多方面BDNF和FGF－1發(fā)揮著重要作用。Alam等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)FGF－1的啟動(dòng)因子B是FGF－1基因表達(dá)的必要因子，其在調(diào)控FGF－1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)〔11〕BDNF調(diào)節(jié)區(qū)Ⅸ的啟動(dòng)可促進(jìn)更多的BDNF表達(dá)，抑制DNA甲基化酶的活動(dòng)可使得BDNF調(diào)節(jié)區(qū)Ⅸ的DNA不發(fā)生甲基化從而對(duì)調(diào)節(jié)區(qū)Ⅸ的啟動(dòng)有促進(jìn)作用。說(shuō)明BDNF調(diào)節(jié)區(qū)ⅨDNA脫甲基有促進(jìn)BDNF表達(dá)作用。研究發(fā)現(xiàn)，電刺激可以誘導(dǎo)腦組織Gadd45β的表達(dá)，大鼠缺失Gadd45β基因后，在電刺激等活動(dòng)誘發(fā)的成熟海馬區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和新生神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)中存在明顯缺陷，Gadd45β通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF和FGF－1的脫甲基化促進(jìn)BDNF等以旁分泌的形式分泌〔1〕。BDNF和 FGF－1分泌到腦組織中后就可以發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元和促進(jìn)樹突生長(zhǎng)的作用。以上這些研究發(fā)現(xiàn)提示，Gadd45β在調(diào)節(jié)神經(jīng)修復(fù)和再生中，可能是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，對(duì)其調(diào)控機(jī)制及其在神經(jīng)修復(fù)中的作用進(jìn)行系統(tǒng)深入研究有可能對(duì)腦卒中后的神經(jīng)功能康復(fù)治療等方面帶來(lái)新思路。

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