松花粉對(duì)衰老成纖維細(xì)胞線粒體DNA缺失突變的影響

喻 陸 史春夏(解放軍305醫(yī)院，北京 0007)

線粒體DNA(mtDNA)損傷學(xué)說認(rèn)為衰老是因?yàn)闄C(jī)體組織線粒體缺乏DNA損傷修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致mtDNA氧化損傷累積所致，主要是mtDNA缺失突變引起線粒體氧化磷酸化功能受損，導(dǎo)致能量產(chǎn)出缺陷、衰老、死亡〔1〕。國(guó)內(nèi)外研究表明，哺乳動(dòng)物mtDNA損傷隨增齡積累，且與生物衰老之間存在高度的相關(guān)性〔2〕。松花粉藥名松黃，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、藥理作用廣的中藥，我實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示松花粉具有較好的抗成纖維細(xì)胞衰老的作用〔3〕，因此本次實(shí)驗(yàn)研究松花粉對(duì)衰老成纖維細(xì)胞mtDNA缺失突變的影響，以期進(jìn)一步闡釋松花粉延緩細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理 人胚肺2BS細(xì)胞由北京生物制品研究所建株，28代引入。培養(yǎng)于15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。體外培養(yǎng)最多可分裂60～70代。一般認(rèn)為30代以下為年輕細(xì)胞，55代以上為衰老細(xì)胞。至30代時(shí)隨機(jī)取8瓶作為年青對(duì)照組，至56代時(shí)隨機(jī)取16瓶分成衰老組、松花粉組，每組 8瓶。參照文獻(xiàn)〔4〕配制松花粉血清液，使其終濃為240 mg/dl(松花粉處理組);對(duì)照組分為青年組、衰老組。松花粉組從28代起使用松花粉血清液連續(xù)培養(yǎng)2BS細(xì)胞;對(duì)照組從28代起連續(xù)培養(yǎng)，采用對(duì)照培養(yǎng)基(同體積DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度約90%時(shí)，按1∶2或1∶4傳代，細(xì)胞傳代后如3周內(nèi)不能融合，則停止傳代。

1.2 儀器與試劑 松花粉由中國(guó)林業(yè)學(xué)院亞熱帶林業(yè)研究所提供，為天然破壁松花粉。PCR儀(美國(guó)Perkin-Elmer公司，9600型);凝膠成像儀(Bio-Rad)。類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)購自民海生物，DMEM培養(yǎng)基(含非必需氨基酸、谷胺酰胺)為Invitrogen產(chǎn)品。細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-gal)染色試劑盒(上海杰美)。mtDNA試劑盒，購于上海生物工程研究中心。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及單細(xì)胞面積測(cè)定 各組細(xì)胞相差顯微鏡下觀察形態(tài)改變(×400)。

1.3.2 β-gal染色 將成纖維細(xì)胞接種于蓋玻片上。在松花粉作用于不同時(shí)間后，PBS洗一次，用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞45 min，用X-半乳糖苷酶(X-gal)染液，37℃保溫4～8 h。染液含 20 mmol/L X-gal、40 mmol/L 醋酸-磷酸鈉(pH6.0)、5 mmol/L鐵氰化鉀、5 mmol/L亞鐵氰化鉀、150 mmol/L氯化鈉、2 mmol/L氯化鎂。室溫顯色過夜。衰老細(xì)胞呈深藍(lán)色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)mtDNA4977的表達(dá) mtDNA4977基因的引物由上海生工合成，基因序列參照文獻(xiàn)〔5，6〕設(shè)計(jì)，檢測(cè)mtDNA4977缺失后線粒體DNA-loop區(qū)引物序列為上游引物:5'-CCC TTA AAT AAG ACA TCA CGA TG-3';下游引物:5'-GTT AGTTGG GGG GTG ACT GT-3'，跨越468 bp的片段。參考文獻(xiàn)〔4，5〕本研究同時(shí)采用總mtDNA一段保守序列擴(kuò)增作為內(nèi)參，上游引物5'-AGGACTTAACCAGACCCAAACACG-3'，下游引物為 3'-CCTTTTTCTGATAGGCGGG-5'，長(zhǎng)度 700 bp，用于代表mtDNA的總量，由上海生工合成。mtDNA提取與測(cè)定:采用mtDNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總mtDNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值并計(jì)算mtDNA濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段完整性。PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系為50 μl，mtDNA量約2 μl(50 ng)，引物各0.5 μl(內(nèi)參和目的基因引物各25 pmol)，dNTPS 5.0 μl(200 μmol/L)，10 × Buffer 5.0 μl，加 ddH2O 至總體積49 μl，將除Taq酶以外所有反應(yīng)成分加入0.5 ml小離心管中，覆蓋石蠟40 μl，短暫離心，94℃預(yù)變性2 min，加入Taq酶1 μl(2.5 U)，進(jìn)入如下循環(huán):94℃ 30 s→ 56℃ 30 s→72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物鑒定及分析:取PCR產(chǎn)物8 μl，在含EB終濃度為0.5 μg/ml的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行掃描定量分析。PCR產(chǎn)物分析軟件對(duì)各電泳條帶得出各PCR產(chǎn)物的平均灰度值。用DNA4977片段缺失后擴(kuò)增的468 bp灰度值與內(nèi)參片段灰度值的比值代表缺失突變線粒體DNA 在總線粒體 DNA 中的相對(duì)比例〔5，6〕。

1.3.4 細(xì)胞SOD活性、MDA含量測(cè)定 分別收集各組細(xì)胞，反復(fù)凍融細(xì)胞，使細(xì)胞脹破，離心取上清液，按試劑盒說明書中的方法測(cè)定血清中的SOD活性、MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 觀察發(fā)現(xiàn)年青細(xì)胞平均兩天呈致密單層，細(xì)胞長(zhǎng)梭形，排列成束狀，界限清晰，細(xì)胞飽滿，折光度好，立體感強(qiáng);衰老細(xì)胞形成單層時(shí)間延長(zhǎng)，邊緣不整齊，排列紊亂，折光度下降，可呈棱形、三角形，表面有微小泡狀突起，胞質(zhì)內(nèi)有顆粒樣物聚集;用松花粉老年細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)梭形，邊緣整齊，排列成束狀，折光度好，立體感強(qiáng)。見圖1。

2.2 衰老相關(guān)β-gal檢測(cè) 細(xì)胞固定后用X-gal染色測(cè)其βgal活性，細(xì)胞呈深藍(lán)色的為衰老細(xì)胞(圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-gal染色陽性細(xì)胞百分比在青年組為(8.42±3.58)%，衰老組為(89.42±5.28)%，240 mg/dl松花粉組為(18.22±8.28)%。衰老組較青年組顯著增高(P＜0.001)，松花粉組均較衰老組顯著降低(P＜0.001)。結(jié)果表明，松花粉可以抑制組織細(xì)胞衰老，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)圖(×400)

圖2 細(xì)胞衰老相關(guān)β-gal染色圖(×100)

2.3 各組細(xì)胞SOD、MDA含量測(cè)定結(jié)果 衰老組細(xì)胞SOD明顯低于青年組(P＜0.05)，而MDA含量明顯高于青年組(P＜0.05);松花粉組細(xì)胞SOD活性明顯高于衰老組(P＜0.05)，而MDA含量明顯低于衰老組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞SOD活性、MDA含量(±s，n=8)

表1 各組細(xì)胞SOD活性、MDA含量(±s，n=8)

與青年組比較:1)P＜0.05，與衰老組比較:2)P＜0.05

組別 SOD活性(U/ml) MDA含量(nmol/ml)39.68±4.87 19.36±3.4衰老組 15.27±3.111) 44.71±3.71)松花粉組 37.69±4.212) 21.34±4.72)青年組

2.4 PCR結(jié)果

2.4.1 線粒體總DNA完整性分析 各組DNA的提取后的線粒體DNA，產(chǎn)物在紫外燈下OD260進(jìn)行比色分析計(jì)算含量，OD260/OD280在1.8～2.0之間說明純度較好。線粒體DNA的全長(zhǎng)16 kb，通過瓊脂糖電泳可以看見抽提的線粒體總DNA，片段完整，無蛋白質(zhì)污染，可用于RT-PCR反應(yīng)。見圖3。

2.4.2 mtDNA4977的電泳表達(dá)結(jié)果 各組均呈現(xiàn)2條清晰的條帶，700 bp為內(nèi)參片段，468 bp為mtDNA D-loop區(qū)片段。通過軟件分析mtDNA4977/內(nèi)參作為半定量結(jié)果，衰老細(xì)胞組缺失突變(28.689 4)在mtDNA中的比例均顯著高于另外兩組(均P＜0.05)，是青年細(xì)胞組的6.21倍(4.615 2)，而衰老細(xì)胞組缺失突變(28.689 4)在mtDNA中的比例是松花粉處理組的2.55倍(11.263 5)。見圖4。

圖3 總DNA完整性分析

圖4 mtDNA4977基因RT-PCR電泳圖

3 討論

自1989年Limrane等提出線粒體衰老假說以來，人們?cè)絹碓疥P(guān)注線粒體與衰老的關(guān)系。隨著衰老的進(jìn)程，有絲分裂后組織中mtDNA缺失和點(diǎn)突變隨之出現(xiàn)〔7〕，而且在老年個(gè)體中達(dá)到高水平，尤其在負(fù)責(zé)mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域突變尤為明顯，mtDNA突變的增加加速了衰老進(jìn)程〔8〕。Jou等〔9〕的研究結(jié)果也證實(shí)mtDNA的缺失突變與衰老的相關(guān)性。

目前認(rèn)為mtDNA突變隨增齡積累是導(dǎo)致衰老的重要因素之一，而活性氧(ROS)損傷是衰老時(shí)mtDNA突變的主要原因。衰老時(shí)常見的mtDNA突變有三種:①缺失突變;②點(diǎn)突變;③重排。其中mtDNA缺失突變研究最多，發(fā)生頻率也最高，與衰老及疾病的關(guān)系較為密切。較常見的與衰老相關(guān)的缺失突變則是4 977 bp～5 kb片段的缺失，在心、骨骼肌和腎等各臟器中均可找到該突變，稱之為“共有缺失”。mtDNA是位于線粒體基質(zhì)內(nèi)的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，線粒體mtDNA基因排列緊湊，無內(nèi)含子，部分區(qū)域出現(xiàn)基因的重疊，幾乎每個(gè)堿基都用于基因組建。因此任何突變都會(huì)累及到基因組中的一個(gè)重要功能區(qū)域，最終導(dǎo)致氧化磷酸化功能受損導(dǎo)致能量產(chǎn)出缺陷、衰老和細(xì)胞死亡。

缺失mtDNA損傷類型以片段缺失最普通，mtDNA突變隨年齡的增長(zhǎng)而增多，使mtDNA基因組高突變率常作為衰老過程的潛力生物學(xué)標(biāo)記〔10〕。目前認(rèn)為mtDNA缺失隨增齡的積累是衰老的重要因素之一，已有大量研究證實(shí)人類或動(dòng)物的各種組織細(xì)胞中mtDNA缺失均隨增齡而增加，其中4 977 bp缺失在人體中研究最多。Gerhard等〔11〕用PCR方法在胎兒、青年、老年三個(gè)年齡組的皮膚成纖維 細(xì)胞都檢測(cè)到4 977 bp缺失，其中老年組最高，大于0.3%。Barron等〔12〕同樣用 PCR方法在14～94歲人的黃斑中檢測(cè)到4 977 bp缺失漸進(jìn)性積累，其中60～94歲缺失增加顯著，從0.25%～5.39%。

mtDNA由于其損傷修復(fù)系統(tǒng)有限，本身的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)又位于線粒體內(nèi)膜附近，裸露于內(nèi)膜氧化呼吸鏈產(chǎn)生的大量自由基環(huán)境中，易遭受氧化損傷。因此mtDNA突變率是核基因的10～20倍，可使mtDNA發(fā)生大片段的缺失突變。因長(zhǎng)期遭受自由基的攻擊，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物mtDNA具有極高的突變率。機(jī)體的正常代謝產(chǎn)物中活性氧(ROS)及氧自由基是mtDNA損害的主要原因。ROS能攻擊許多不同的細(xì)胞大分子，包括蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和DNA。其中對(duì)衰老而言，ROS對(duì)DNA的傷害是最重要的，mtDNA在位置上非常接近線粒體ROS產(chǎn)生部位，隨著衰老的進(jìn)程，有絲分裂后組織中mtDNA缺失和點(diǎn)突變隨之出現(xiàn)，而且在老年個(gè)體中達(dá)到高水平，尤其在負(fù)責(zé)mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域尤為明顯，mtDNA突變的增加，加速了衰老進(jìn)程。另一方面ROS可激活線粒體透性轉(zhuǎn)變通道(mtPTP)，造成能量缺損和氧化性損傷，引起細(xì)胞凋亡〔2〕。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA，一方面它可能引起細(xì)胞代謝及功能障礙甚至死亡，其含量與細(xì)胞損傷的程度呈正相關(guān)，可間接反映出機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。另一方面它可以通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大ROS的作用。抗氧化物質(zhì)SOD是機(jī)體清除過多ROS及氧自由基的主要物質(zhì)，能夠降低其對(duì)機(jī)體的氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)首先從總mtDNA中進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)mtDNA4977，并設(shè)計(jì)總mtDNA中總長(zhǎng)度為700 bp的片段作為內(nèi)參，通過mtDNA4977/內(nèi)參比例結(jié)果反應(yīng)缺失突變mtDNA4977在總mtDNA中的比例，這一數(shù)據(jù)也可以較好的反應(yīng)各自間的倍數(shù)關(guān)系。本文結(jié)果表明mtDNA4977缺失突變與細(xì)胞的衰老有關(guān)，同時(shí)松花粉抗衰老的作用可能與降低mtDNA4977缺失突變有著密切的關(guān)系。同時(shí)進(jìn)行松花粉對(duì)細(xì)胞體內(nèi)氧化環(huán)境的影響結(jié)果看，松花粉能明顯增加細(xì)胞體內(nèi)的SOD活性，降低其中MDA的含量。因此，推測(cè)松花粉降低抑制衰老成纖維細(xì)胞mtDNA缺失突變的作用可能通過降低細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)的氧化損傷有著密切的關(guān)系。

本研究結(jié)果初步揭示了松花粉可以降低線粒體DNA的缺失突變，其抗衰老作用可能與這一生理作用有關(guān)。這一研究結(jié)果為中醫(yī)延緩衰老開辟了新的研究途徑，對(duì)了解線粒體DNA在細(xì)胞衰老中的作用和細(xì)胞凋亡與衰老關(guān)系的研究，以及揭示細(xì)胞衰老的機(jī)制都將具有重要意義。

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