不同劑量弗氏完全佐劑對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠復(fù)制的影響

彭傳玉 羅 磊 胡 玲 宋小鴿 唐照亮 吳子建 蔡榮林 郝 峰 胡吳斌

（安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230038）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis, RA）是以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病[1]，我國(guó)患病率約為0.32%～0.36%[2]，是造成人類(lèi)勞動(dòng)力喪失和致殘的主要因素之一[3]。建立一個(gè)實(shí)用而可靠的動(dòng)物模型是深入研究RA發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物療效的重要手段。目前，RA的動(dòng)物模型復(fù)制有多種方法[4,5]，其中弗氏完全佐劑（Eph's complete adjuvant，F(xiàn)CA）誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（Adjuvant Arthritis，AA）最為經(jīng)典、最為常用。但是關(guān)于模型復(fù)制中弗氏完全佐劑使用的劑量與模型復(fù)制之間的關(guān)系的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔接慠A模型復(fù)制中弗氏完全佐劑的最佳注射量，以期提供較為準(zhǔn)確、全面、持久的模型復(fù)制方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

選擇清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200g，月齡3～4個(gè)月，80只，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0004。實(shí)驗(yàn)前將大鼠放置鼠籠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前根據(jù)第四版《衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)》隨機(jī)編號(hào)表將動(dòng)物隨機(jī)分為 4組，分別為正常組、0.1mL模型復(fù)制組（0.1組）、0.15mL模型復(fù)制組（0.15組），0.2mL模型復(fù)制組（0.2組）。并用苦味酸給各組的大鼠染色以標(biāo)記編號(hào)。大鼠自由飲食，自然光照，并定期清潔、消毒。

1.2 材料與儀器

弗氏完全佐劑：美國(guó)SIGMA公司，10mL，068K8761；電子稱(chēng)：蘇州蘇靈儀表有限公司，ACS-6；X儀器：X射線(xiàn)機(jī)Kadak Directview（DR7500）。

1.3 模型復(fù)制方法

實(shí)驗(yàn)采用“病證結(jié)合”復(fù)合佐劑性關(guān)節(jié)炎模型復(fù)制方法[6]，即風(fēng)、寒、濕環(huán)境因素+弗氏完全佐劑。實(shí)驗(yàn)用大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常組外，其余各組大鼠置于風(fēng)、寒、濕環(huán)境喂養(yǎng)20d。第21天，于大鼠右后足跖部經(jīng)酒精消毒后，不同組別的每只大鼠分別注入0.1mL、0.15mL、0.2mL弗氏完全佐劑?？梢?jiàn)24h后各模型組大鼠右后足跖部明顯腫脹，48h后可見(jiàn)繼發(fā)性炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為前肢或?qū)?cè)肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結(jié)節(jié)出現(xiàn)，示造模成功。

1.4 觀(guān)察和檢測(cè)指標(biāo)

①體質(zhì)量：各組大鼠分別于模型復(fù)制前、模型復(fù)制成功后第1天、模型復(fù)制成功后第10天，使用電子稱(chēng)于同一時(shí)間、地點(diǎn)稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量并做記錄。②跖圍：各組大鼠分別于模型復(fù)制前、模型復(fù)制成功后第1天、模型復(fù)制成功后第10天，于同一時(shí)間、地點(diǎn)測(cè)量大鼠跖圍。跖圍測(cè)量方法：在同一時(shí)間用手術(shù)線(xiàn)環(huán)繞大鼠右下足跖部相應(yīng)骨性標(biāo)志處測(cè)量其圍長(zhǎng)。③大鼠關(guān)節(jié)X線(xiàn)觀(guān)察：模型復(fù)制成功后第10天，各組大鼠分別置于X線(xiàn)下觀(guān)察其關(guān)節(jié)骨性變化。由多年經(jīng)驗(yàn)放射科醫(yī)師指導(dǎo)完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)前后大鼠體質(zhì)量的比較

模型復(fù)制前，各模型組大鼠與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型復(fù)制成功后第1天，各模型組大鼠與正常組相比，體質(zhì)量均有所減輕，具有明顯的差異性（P＜0.05）。模型復(fù)制成功后第10天，0.1mL模型復(fù)制組體質(zhì)量有所恢復(fù)，0.15mL模型復(fù)制組和0.2mL模型復(fù)制組體質(zhì)量逐漸減輕，0.1mL模型復(fù)制組、0.15mL模型復(fù)制組、0.2mL模型復(fù)制組與正常組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 FCA不同注射量對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量的影響（g）

2.2 實(shí)驗(yàn)前后大鼠趾圍的比較

模型復(fù)制前，各模型組大鼠與正常組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型復(fù)制成功后1d，各模型組大鼠與正常組比較，趾圍均有增加，有顯著性差異（P＜0.05）；0.1mL模型復(fù)制組、0.15ml模型復(fù)制組、0.2mL模型復(fù)制組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.示造模成功；模型復(fù)制成功后第10天，0.1mL模型復(fù)制組腫脹有所減輕，0.15mL模型復(fù)制組和0.2mL模型復(fù)制組腫脹持續(xù)性加重，0.15組、0.2組與正常組、0.1組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.1組與與正常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 FCA不同注射量對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠趾圍的影響（cm）

2.3 FCA不同注射量的RA大鼠X線(xiàn)比較

注射量為0.1mL的RA大鼠的X線(xiàn)表現(xiàn)為軟組織的輕微腫脹，致炎不完全，后期繼發(fā)性全身炎癥反應(yīng)不明顯，而且在后期慢性炎癥階段出現(xiàn)自愈趨勢(shì)。注射量為0.15mL的RA大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)周?chē)能浗M織明顯腫脹，關(guān)節(jié)破壞明顯，隨著病情的發(fā)展出現(xiàn)全身性繼發(fā)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)面愈趨模糊，近關(guān)節(jié)處骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)侵襲，尤其關(guān)節(jié)處出現(xiàn)結(jié)節(jié)增生，且不斷增大，僵硬。注射量為0.2mL的RA大鼠的X 線(xiàn)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟組織明顯腫脹，骨質(zhì)嚴(yán)重侵襲，關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重，與臨床類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨破壞相差較大。見(jiàn)圖1～4。

圖1 正常組大鼠X線(xiàn)表現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織未見(jiàn)腫脹，關(guān)節(jié)間隙正常，未見(jiàn)骨性改變，關(guān)節(jié)面密度均勻

圖20 .1mL模型復(fù)制組X線(xiàn)表現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹存在，關(guān)節(jié)間隙基本正常，未見(jiàn)骨性改變，關(guān)節(jié)面密度稍低且不均勻，有自愈現(xiàn)象

圖30 .15mL模型復(fù)制組X線(xiàn)表現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹明顯，關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨破壞，關(guān)節(jié)面模糊毛糙，關(guān)節(jié)關(guān)系正常，與臨床類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨改變較為接近

圖40 .2mL模型復(fù)制組X線(xiàn)表現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織病損，顯像密度不均勻，可見(jiàn)踝關(guān)節(jié)骨折，骨質(zhì)疏松與關(guān)節(jié)面受損嚴(yán)重，與臨床類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨改變相差較遠(yuǎn)

3 討 論

佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型是細(xì)菌學(xué)家Freund于20世紀(jì)50年代創(chuàng)立，又稱(chēng)弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，是研究免疫性動(dòng)物模型的基本方法[7,8]，不同的弗氏佐劑注射量影響造模的成功率、實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

本實(shí)驗(yàn)分別從局部病變、全身癥狀、骨質(zhì)變化等方面探討了RA模型復(fù)制中不同弗氏佐劑注射量的對(duì)模型復(fù)制的影響，以期為RA的實(shí)驗(yàn)研究中提供較好的模型復(fù)制方法，為臨床觀(guān)察提供較為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在造模成功后第1天，模型組大鼠與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是由于大鼠機(jī)體機(jī)能受到抑制，進(jìn)食飲水量減少導(dǎo)致所成。但是在造模成功后第10天，可見(jiàn)0.1mL模型組大鼠體質(zhì)量有所回升，0.15mL模型復(fù)制組和0.2mL模型復(fù)制組大鼠體質(zhì)量始終保持下降趨勢(shì)，0.2mL模型復(fù)制組大鼠體質(zhì)量下降較為明顯，但模型組大鼠均與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。就跖圍而言，在造模成功后第1天，與正常組大鼠比較，各模型組大鼠出現(xiàn)跖關(guān)節(jié)明顯紅腫，表現(xiàn)為早期的炎性反應(yīng)，在造模成功后第10天，0.1mL模型復(fù)制組大鼠腫脹有所減輕，0.15mL模型復(fù)制組和0.2mL模型復(fù)制組關(guān)節(jié)腫脹呈進(jìn)行性加重趨勢(shì)，大鼠行動(dòng)不便。0.2mL模型復(fù)制組跖圍腫脹最為明顯，加重趨勢(shì)比較嚴(yán)重。

0.1mL模型復(fù)制組大鼠X線(xiàn)造模后與造模前相比，軟組織輕微腫脹，關(guān)節(jié)破壞不明顯。0.15mL模型復(fù)制組的RA大鼠足趾的軟組織腫脹明顯，關(guān)節(jié)間隙變窄，邊緣性骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)變形，且尾部關(guān)節(jié)可見(jiàn)部分風(fēng)濕結(jié)節(jié)。0.2mL模型復(fù)制組的RA大鼠足趾腫脹明顯，骨質(zhì)嚴(yán)重侵蝕，關(guān)節(jié)破壞明顯，可見(jiàn)粉碎性骨性改變。

綜上所述，注射量為0.15mL的RA大鼠在關(guān)節(jié)的局部出現(xiàn)病變?nèi)缂t腫、皮溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、變形、X線(xiàn)改變等較為接近人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的改變，同時(shí)其進(jìn)食飲水量的減少導(dǎo)致體質(zhì)量的下降、精神萎靡等全身癥狀，與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者癥狀較為相似。另一方面，筆者認(rèn)為，臨床上類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者大部分處于慢性進(jìn)行性骨性改變期，建立一個(gè)能夠持久的模型復(fù)制方法是觀(guān)察類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵所在。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)0.15mL弗氏完全佐劑注射量在其局部癥狀、骨質(zhì)的X線(xiàn)變化較為貼近臨床患者的局部病理變化，可能是RA模型復(fù)制中的最佳注射劑量。

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