人肺腺癌細(xì)胞A549耐藥細(xì)胞系的建立及意義

劉利則 夏 莉 段北野 劉玉俠 (吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 3002)

盡管少數(shù)早期肺癌患者可以通過手術(shù)治療達(dá)到根治的效果，但70%的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者確診時已屬臨床晚期，無法通過手術(shù)治愈。含鉑類雙藥化療方案是晚期NSCLC標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，其中順鉑(cDDP)是使用廣泛的化療藥物之一〔1〕。但是隨著治療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞會對化療藥物產(chǎn)生耐藥，這是造成化療療效不佳及失敗的主要原因之一〔2〕。如何保持腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性是廣大腫瘤工作者研究的課題。本實驗擬建立人肺腺癌A549耐藥細(xì)胞系，為藥物逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基:Gibco產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT):Sigma產(chǎn)品;胎牛血清:天津TB公司;二甲基亞砜(DMSO):Sigma產(chǎn)品;順鉑:購于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;瓊脂糖、DNA標(biāo)準(zhǔn)品:寶泰克公司產(chǎn)品。

1.1.2 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 購于上海生命科學(xué)研究院。

1.1.3 主要設(shè)備及器材 低溫低速離心機(jī)，SORVALL RTT，USA;全自動酶標(biāo)儀，Labsystems Dragon;萬能視頻成像系統(tǒng)(LY-WN-HPCCD)都勵揚(yáng)精密機(jī)電有限公司。

1.2 實驗方法.

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將A549細(xì)胞從液氮罐中取出復(fù)蘇后，加入含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 耐藥細(xì)胞株A549/cDDP建立 當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長期且已鋪滿瓶底80%以上時，棄去原來培養(yǎng)液，加入含順鉑培養(yǎng)液(終濃度為100 μmol/L)，培養(yǎng)1 h后棄去含順鉑培養(yǎng)基，更換為新鮮配制的含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，拍照。待細(xì)胞長滿瓶時，用0.25%胰酶消化傳代。再長滿瓶底時再用同樣濃度同樣方法沖擊，再培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，拍照，再傳代。如此，體外連續(xù)培養(yǎng)、沖擊、傳代，并同時進(jìn)行抗藥性檢測。反復(fù)凍存，復(fù)蘇，觀察細(xì)胞株生長穩(wěn)定性。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞抗藥性 復(fù)蘇人肺腺癌細(xì)胞株A549和經(jīng)過順鉑沖擊處理的A549/cDDP細(xì)胞，用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液重懸，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至指數(shù)生長期時，0.25%胰酶消化，生理鹽水洗滌，計數(shù)。用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，加入 96 孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，置于 CO2培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后加入受試藥物cDDP，終濃度分別是 200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同時設(shè)陰性對照(以等體積的生理鹽水代之)和空白對照(無細(xì)胞)。各組設(shè)6復(fù)孔。37℃、5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)72 h后加入 MTT(5 mg/ml)，20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)上清。加入DMSO，150 μl/孔，振蕩10 min，使結(jié)晶物全部溶解后，用全自動酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A)，波長為492 nm。求出不同濃度cDDP對兩種細(xì)胞的抑制率。計算公式:抑制率=〔1－(實驗組均值/陰性對照組均值)〕×100%;計算50%細(xì)胞生長抑制所需的藥物濃度(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)。RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.4 A549順鉑耐藥細(xì)胞基因檢測 檢測多藥耐藥基因特異序列(167 bp)的表達(dá)，用PCR擴(kuò)增法。引物設(shè)計:上游CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG，下游GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。PCR擴(kuò)增:在離心管內(nèi)加入下列內(nèi)容物:10倍緩沖液，2.5 μl;MgCl2，2.5 μl;dNTP(2 mmol/L)，2.5 μl;引物，1.0 μl;DDW，14.0 μl;Target，2.0 μl;95℃，5 min 后加 Tag，0.5 μl。94℃，30 s;55℃，60 s;72℃，70 s;共 30 個循環(huán)，72℃ 延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測多藥耐藥基因特異片段(167 bp)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長狀態(tài)及生長特征 細(xì)胞在接受大劑量cDDP沖擊后，出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)銳減;生長緩慢，出現(xiàn)單個細(xì)胞克隆，層疊生長，傳代后恢復(fù)單層排列。再次大劑量沖擊后殘存細(xì)胞再次層疊生長，傳代后依然恢復(fù)單層排列。A549細(xì)胞經(jīng)大劑量cDDP反復(fù)沖擊后，細(xì)胞生長變緩慢，細(xì)胞體積變大，邊界清楚。見圖1。

圖1 經(jīng)大劑量cDDP沖擊后細(xì)胞生長狀態(tài)

2.2 不同次數(shù)cDDP沖擊后細(xì)胞耐藥性測定結(jié)果 分別檢測經(jīng)大劑量cDDP沖擊10次和12次以后，不同濃度cDDP對親本細(xì)胞和耐藥誘導(dǎo)細(xì)胞的生長抑制情況。見表1，表2。沖擊10次時對照組和 A549細(xì)胞的 IC50分別為24.33、65.65 μmol/L，RI為2.7;沖擊12次時對照組和 A549細(xì)胞的IC50 分別為 19.61、81.58 μmol/L，RI為 4.2。

2.3 多藥耐藥基因特異片段(167 bp)的檢測結(jié)果 見圖2。從電泳結(jié)果可見，在167 bp附近有一條泳帶。證明提取人肺腺癌細(xì)胞A549順鉑耐藥細(xì)胞有多藥耐藥特異基因的表達(dá)。

表1 大劑量cDDP沖擊10次后A549/cDDP細(xì)胞的藥物檢測(±s)

表1 大劑量cDDP沖擊10次后A549/cDDP細(xì)胞的藥物檢測(±s)

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表2 大劑量cDDP沖擊12次后A549/cDDP細(xì)胞的藥物檢測(±s)

表2 大劑量cDDP沖擊12次后A549/cDDP細(xì)胞的藥物檢測(±s)

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圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測多藥耐藥基因PCR擴(kuò)增片段

3 討論

目前，晚期NSCLC一線標(biāo)準(zhǔn)化療方案是兩種三代含鉑藥物聯(lián)合。順鉑具有類似烷化劑雙功能基團(tuán)，與細(xì)胞內(nèi)親核基團(tuán)結(jié)合，主要與DNA鏈上的堿基作用，改變其正常復(fù)制模板的功能，引起DNA復(fù)制障礙，從而抑制癌細(xì)胞分裂。

多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對結(jié)構(gòu)和功能不同的多種藥物都產(chǎn)生了耐藥。多藥耐藥的發(fā)展源于單用高劑量給藥或聯(lián)合用藥后存活下來的部分細(xì)胞〔3，4〕。根據(jù)這一原理，本實驗通過用順鉑反復(fù)沖擊人肺腺癌A549細(xì)胞，建立人肺腺癌A549順鉑耐藥細(xì)胞系，為藥物逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞提供實驗基礎(chǔ)。

本文結(jié)果證明，經(jīng)10次和12次沖擊后，A549細(xì)胞對順鉑具有較強(qiáng)的耐受力，A549/DDP耐藥細(xì)胞內(nèi)有耐藥基因的表達(dá)。因此，本實驗建立了A549/DDP耐藥細(xì)胞株。該細(xì)胞株通過反復(fù)凍存、復(fù)蘇后，仍能高表達(dá)耐藥基因，具有很好穩(wěn)定性，為藥物逆轉(zhuǎn)實驗奠定了基礎(chǔ)。

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2 Aandrews J，Yeh P，Pao W，et al.Molecular predictors of response to chemotherapy in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer J，2011;17(2):104-13.

3 Jabr-Milanc LS，van Vlerken LE，Yadav S，et al.Multi-functional nanocarriers to overcome tumor drug resistence〔J〕.Cancer Treat Rev，2008;34(7):592.

4 Meijerman I，Beijnen JH，Schellens JH，et al.Combined action and regulation of phageⅡenzymes and multidrug resistence proteins in multidrug resistence in cancer〔J〕.Cancer Treat Rev，2008;34(6):505.