性發(fā)育異?；颊叩募?xì)胞分子遺傳學(xué)分析*

滕奔琦，王青青，章 鈞，李佩瓊，郝秀蘭，侯紅瑛△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630;2廣州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510182)

性發(fā)育異常是一種先天遺傳性異常，通常表現(xiàn)為染色體、性腺和性解剖結(jié)構(gòu)不典型，一般發(fā)病率為1‰～3‰，根據(jù)其定義性發(fā)育異?？煞譃?個(gè)類型:性染色體、46，XX 和46，XY 發(fā)育異常[1-2]，其發(fā)病機(jī)制不詳。目前越來越多研究表明，性別的決定和分化，是由SRY(sex-determining region Y)基因主導(dǎo)，其它性別相關(guān)基因如編碼轉(zhuǎn)錄因子的SOX9基因、DSS基因、DAX－1基因、NR5A1基因及編碼細(xì)胞信號(hào)分子的WNT4基因、CYP21A2及CYP21A1P基因等多種基因共同參與和調(diào)控的復(fù)雜過程。本文分析了3例46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征及1例女性假兩性畸形患者的臨床特點(diǎn)，并采用多重連接依賴的探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)對患者 SRY、DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1、CYP21A2等性別相關(guān)基因拷貝數(shù)進(jìn)行篩查，最終采用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)進(jìn)行基因定位，對性發(fā)育異?；颊哌M(jìn)行了細(xì)胞及分子遺傳學(xué)研究，從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步分析性發(fā)育異常機(jī)制。

材料和方法

1 臨床資料

選取2010年12月份至2011年4月份來我院就診的3例男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者，臨床均表現(xiàn)為無精子癥、不育;染色體核型分析均為46，XX。1例女性假兩性畸形患者，由于其已死亡，故選擇其父母作為先證者進(jìn)行性別相關(guān)基因分析。

2 方法

2.1 MLPA檢測與分析

2.1.1 MLPA檢測 采用SALSA P185-B2試劑盒(購自MRC Holland)，SALSA試劑盒包括的探針包括:NR0B1、SRY、SOX9、DAX1、WNT4、NR5A1、CYP21A2、CYP21A1P及X、Y染色體特異性基因探針，有6個(gè)參考基因探針以檢測不同的常染色體基因定位。MLPA操作過程按照說明書進(jìn)行，50 ng DNA在98℃變性5 min，然后和SALSA探針混合物混勻;60℃雜交過夜后，用連接酶(Ligase-65)54℃連接15 min，再98℃孵育5 min終止反應(yīng)，最后使用SALSA FAM PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物1 μL應(yīng)用ABI3100測序儀進(jìn)行片段分析，每次反應(yīng)均以正常男性標(biāo)本作為對照，所得數(shù)據(jù)采用Gene-Marker 1.8軟件進(jìn)行處理，以正常男性的數(shù)據(jù)為對照，計(jì)算片段擴(kuò)增或缺失的情況。

2.1.2 MLPA結(jié)果分析及確證方法 根據(jù)MLPA探針混合物中的引物序列捕獲片段大小不一的DNA區(qū)域，通過毛細(xì)管電泳并檢測，獲得不同片段遷移的相對位置的圖像和數(shù)據(jù)。GeneMarker 1.8軟件通過對這些位置上出現(xiàn)的峰面積進(jìn)行標(biāo)化和對比，獲得單個(gè)樣本的每一個(gè)峰面積數(shù)值。患者待測基因拷貝數(shù)與正常男性基因拷貝數(shù)比較得出結(jié)果:當(dāng)患者待檢測基因位點(diǎn)存在時(shí)其峰值面積比介于0.75～3.00之間;當(dāng)患者待檢測基因位點(diǎn)不存在時(shí)，其峰值面積比小于0.75;當(dāng)患者待檢測基因存在雙拷貝時(shí)，其峰值面積比大于 1.30[3]。

2.2 FISH探針制備及雜交 X、Y染色體購自Cytocell，分別為青色和綠色熒光。SRY基因FISH探針采用細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosom，BAC)克隆按照切口平移法標(biāo)記紅色熒光[4]。FISH細(xì)胞制片按照常規(guī)的方法進(jìn)行，細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)消化、低滲后進(jìn)行固定，滴片數(shù)張，烤片2 h后經(jīng)梯度乙醇脫水后在選定區(qū)域滴加0.01 mL的探針混合液、封片;將玻片置入雜交儀內(nèi)，變性及雜交過夜;洗滌液洗滌后梯度乙醇脫水、DAPI復(fù)染、閱片。結(jié)果觀察在熒光顯微鏡下進(jìn)行，根據(jù)DAPI顯帶的情況判斷染色體來源、上述信號(hào)位于染色體的位置。分別觀察20組中期分裂相，判斷紅色、綠色與青色熒光信號(hào)的數(shù)目及所處的染色體[4]。

結(jié) 果

1 性反轉(zhuǎn)綜合征檢測結(jié)果

3例性反轉(zhuǎn)綜合征患者社會(huì)性別均為男性，染色體核型均為46，XX，經(jīng)MLPA基因篩查均發(fā)現(xiàn)存在單拷貝 SRY 基因，DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1等性別相關(guān)基因數(shù)目未見異常。FISH技術(shù)鑒定存在2條X染色體，SRY基因易位于其中1條X染色體的短臂上。

2 女性假兩性畸形檢測結(jié)果

女性假兩性畸形患者母親及父親臨床表現(xiàn)無特殊，母親染色體核型為46，XX，MLPA基因篩查發(fā)現(xiàn)CYP21A2-ex03雜合性缺失，CYP21A1P-ex02雜合性重復(fù)，DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性別相關(guān)基因未見異常;父親染色體核型為46，XY，MLPA基因篩查發(fā)現(xiàn)CYP21A2-ex01和CYP21A2-ex03雜合性缺失，CYP21A1P-ex02和CYP21A1-ex10雜合性重復(fù)，DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性別相關(guān)基因未見異常。

3 MLPA檢測結(jié)果

圖1為46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者M(jìn)LPA的驗(yàn)證結(jié)果，圖中可見Xq22、Xq13、Xp22和Xp11所對應(yīng)片段在3100電泳圖上的熒光峰面積分別為1.774、1.513、1.532 和 1.593，表示與正常男性對照相比，待測樣本存在雙拷貝X染色體，即XX;Yp11(SRY)所對應(yīng)片段的熒光峰面積為0.930，表示與正常男性對照一致，不存在缺失或重復(fù)，即SRY(+);Yq11所對應(yīng)片段的熒光峰面積為0.000，表示與正常男性對照該位點(diǎn)的熒光峰完全缺失;NR0B1基因的2個(gè)第一外顯子所對應(yīng)片段的熒光峰面積分別為1.778和1.798;第二外顯子所對應(yīng)片段的熒光峰面積為1.655，表示與正常男性對照相比，待測樣本存在雙拷貝片段。DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性別相關(guān)基因未見異常。

Figure1.MLPA results of one of 46，XX male sex-reversal syndrome.Blue signal stands for sample and red signal stands for normal control.Peaks at 145/235 nt stand for the first exons of NROB1，as well as peak at 310 nt stands for the second exon of NROB1.Peak at 228 nt stands for Xq22.Peak at 370 nt stands for Xp22.Peak at 424 nt stands for Xq13.Peak at 434 nt stands for Xp11.Peak at 163 nt stands for Yp11.Peak at 241 nt stands for Yq11.Arrows indicate differentiated peaks of the sample.圖1 46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者的MLPA檢測結(jié)果

圖2為女性假兩性畸形患者母親的MLPA驗(yàn)證結(jié)果，圖中可見 CYP21A1P-ex02所對應(yīng)片段在3100電泳圖上的熒光峰面積為1.535，表示與正常女性對照相比，待測樣本存在CYP21A1雜合性重復(fù)。CYP21A2-ex03所對應(yīng)片段的熒光峰面積為0.512，表示與正常女性對照相比，待測樣本CYP21A2基因雜合性缺失。DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1 等性別相關(guān)基因未見異常。

Figure2.MLPA results of the proband of female pseudoherma-phroditism.Blue signal stands for sample and red signal stands for normal control.Peak at 265 nt stands for the second exon of CYP21A1，as well as peak at 169 nt stands for the third exon of CYP21A2.Arrows indicate differentiated peaks of the sample.圖2 女性假兩性畸形母親的MLPA驗(yàn)證結(jié)果

圖3為女性假兩性畸形患者父親的MLPA驗(yàn)證結(jié)果，圖中可見 CYP21A1P-ex02和 CYP21A1P-ex10所對應(yīng)片段在3100電泳圖上的熒光峰面積分別為1.685和1.501，表示與正常男性對照相比，待測樣本存在CYP21A1P雜合性重復(fù);CYP21A2-ex01和CYP21A2-ex03所對應(yīng)片段的熒光峰面積分別為0.644和0.523，表示與正常男性對照相比，待測樣本CYP21A2基因雜合性缺失。DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1等性別相關(guān)基因未見異常。

Figure3.MLPA results of the husband of the proband of female pseudoherma-phroditism.Blue signal stands for sample and red signal stands for normal control.Peak at 265 nt stands for the second exon of CYP21A1，as well as peak at 351 nt stands for the tenth exon of CYP21A1.Peak at 200 nt stands for the first exon of CYP21A2，as well as peak at 169 nt stands for the third exon of CYP21A2.Arrows indicate differentiated peaks of the sample.圖3 為女性假兩性畸形父親的MLPA驗(yàn)證結(jié)果

4 FISH結(jié)果

圖4為其中1例46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者的X/Y/SRY染色體圖染分析FISH的驗(yàn)證結(jié)果，3例患者的中期細(xì)胞分裂相上均可以看到2條X染色體(綠色)及1條紅色熒光探針信號(hào)，其中紅色熒光探針信號(hào)與綠色的X染色體著絲粒探針位于同一條染色體上，從位置上判斷其位于短臂上。

Figure4.FISH results of the probes of Y chromosome/SRY and X centromere.Centromere probes of X chromosome exhibit green fluorescence.Red signal stands for probe labeled from Y chromosome.圖4 X/Y/SRY染色體FISH檢測結(jié)果

討 論

性分化與性發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，人類性別分化主要是由性染色體決定的，其中Y染色體在性別決定中起主導(dǎo)作用，而睪丸分化又是性別決定的關(guān)鍵所在。研究表明SRY基因定位于Yp11.23，該基因的獲得或缺失會(huì)引起性發(fā)育異常。但許多研究顯示并不是每個(gè)性發(fā)育異?；颊叨寄芤許RY基因的存在或缺少、正?；虍惓斫忉專詣e決定是以SRY基因?yàn)橹鲗?dǎo)，多個(gè)性別相關(guān)基因共同參與協(xié)調(diào)的結(jié)果。故常規(guī)檢測SRY基因，并不能深入探討性發(fā)育異常患者的發(fā)病機(jī)制[5]。以往只能應(yīng)用PCR技術(shù)對單個(gè)性別相關(guān)基因逐一進(jìn)行研究，本研究應(yīng)用了MLPA技術(shù)，可在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測多個(gè)性別相關(guān)基因的拷貝數(shù)的變化，對其性別相關(guān)基因進(jìn)行拷貝數(shù)篩查。本文在前人研究性發(fā)育異常發(fā)病機(jī)制基礎(chǔ)上，對性發(fā)育異常患者先進(jìn)行染色體核型分析鑒別染色體性別，之后利用MLPA技術(shù)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測 SRY、DSS、DAX1、WNT4、SOX9、NR5A1、CYP21A2等性別相關(guān)基因拷貝數(shù)變化的優(yōu)點(diǎn)，對其性別相關(guān)基因進(jìn)行拷貝數(shù)篩查，然后選擇異?；蚱芜M(jìn)行熒光標(biāo)記定位，進(jìn)一步探討性發(fā)育異常的發(fā)病機(jī)制。

1 46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征

46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者染色體核型為女性，但表型及性腺為男性，又稱為De La Chapelle綜合征，其發(fā)病率在男性中為 1∶20000 ～1∶25000[6]。在臨床上可分為SRY基因陽性及SRY基因陰性患者，SRY基因陽性者約占85%～90%。關(guān)于46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征可能的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，其中大多研究表明Xp-Yp易位假說占主導(dǎo)地位，即父系精子減數(shù)分裂過程中發(fā)生X-Y染色體末端異常交換(Xp-Yp易位)，導(dǎo)致含SRY基因的X型精子產(chǎn)生，當(dāng)其與卵子結(jié)合則可能導(dǎo)致子代46，XX男性產(chǎn)生。如本文3例患者M(jìn)LPA檢測到均含有2條X染色體，且性別決定基因 SRY(+)，X/SRY FISH檢測SRY基因定位在X染色體短臂末端，證實(shí)了Yp-Xp末端交換假說。目前，用分子雜交技術(shù)及PCR技術(shù)已證實(shí)了大部分46，XX男性患者某一X染色體末端存在Y染色體片段[7]。但是46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者在臨床表現(xiàn)上卻有較大的異質(zhì)性，SRY基因陽性者主要表現(xiàn)為青春期后不育、睪丸發(fā)育差等問題，但外生殖器發(fā)育正常，在青春期前與正常男性幾無明顯區(qū)別，故在青春期前不易被發(fā)現(xiàn);SRY基因陰性者，其發(fā)病機(jī)制并不清楚，臨床上主要表現(xiàn)為外生殖器異常，典型的表現(xiàn)為尿道下裂，可在出生后不久發(fā)現(xiàn)異常[8]。

2 女性假兩性畸形

女性假兩性畸形發(fā)病率約為1/40000，其核型為46，XX，性腺是卵巢，有子宮和陰道，外陰表現(xiàn)兩性畸形。最常見原因?yàn)橄忍煨阅I上腺皮質(zhì)增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)，呈常染色體隱性遺傳。其最主要的發(fā)病機(jī)制是21-羥化酶(21-hydroxylase，CYP21)基因突變引起腎上腺皮質(zhì)無法將17-羥孕酮轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)酮;后者合成減少時(shí)，對丘腦下部和垂體前葉的正常反饋消失，導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素增加而刺激腎上腺增生，使分泌的皮質(zhì)酮趨于正常，同時(shí)也刺激腎上腺網(wǎng)狀帶產(chǎn)生大量雄激素，使女嬰出現(xiàn)男性化表型，表現(xiàn)為女性假兩性畸形，而男性則表現(xiàn)為性早熟[9]。由于本實(shí)驗(yàn)室此例患者已死亡，其母親再次妊娠，現(xiàn)孕20周，來我實(shí)驗(yàn)室行產(chǎn)前診斷。對其父母進(jìn)行性別相關(guān)基因檢測，發(fā)現(xiàn)其母親CYP21A2-ex03基因雜合性缺失，CYP21A1P-ex02基因雜合性重復(fù);父親CYP21A2-ex01和CYP21A2-ex03雜合性缺失，CYP21A1P-ex02和CYP21A1P-ex10雜合性重復(fù)。

在臨床工作中如發(fā)現(xiàn)以生殖器發(fā)育異常、成年男性患者不育等為主訴的患者，不僅要進(jìn)行SRY基因分析，還應(yīng)該對其它性別相關(guān)基因如 SOX9、CYP21A1P、CYP21A2等進(jìn)行分析，要在細(xì)胞遺傳學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分子遺傳學(xué)檢測，有利于從基因水平揭示性別發(fā)育異常的原因，可為患者的臨床診斷、治療提供更好的依據(jù)。同時(shí)，產(chǎn)前診斷對于預(yù)防性發(fā)育異常缺陷兒的出生具有一定的意義，當(dāng)產(chǎn)前超聲與細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果不一致時(shí)，需對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

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