不同補腎方法減輕化療后卵巢功能損害的比較研究*

秦佳佳，李瑞滿，吳 倩

(暨南大學1醫(yī)學院中醫(yī)系，2第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510632)

隨著化療的治療進展，很多惡性腫瘤患者可以長期存活甚至治愈。但是化療所引起的卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)而導致的早絕經(jīng)和不孕影響了女性患者的生存質(zhì)量。目前，國內(nèi)外主要應(yīng)用促性腺激素激動劑或雌、孕激素作為化療中卵巢功能的保護藥物[1－2]。但其長期應(yīng)用是否能增加卵巢癌發(fā)生的機率尚存在爭議，從而限制了其臨床的實際應(yīng)用及患者對其的接受程度。目前，應(yīng)用中藥制劑作為化療后卵巢功能防護藥物方面的研究尚屬空白，亦是廣大中醫(yī)學工作者面臨的重要課題。卵巢為女性內(nèi)生殖器官，而“腎主生殖”，主宰著“腎－天癸－沖任－胞宮”之間的協(xié)調(diào)，使其“有子”或“無子”。故防護化療導致的卵巢儲備功能下降應(yīng)從調(diào)補腎陰入手[3]。有學者運用補腎方法治療去卵巢后骨質(zhì)疏松，取得滿意效果[4]。本課題組前期研究亦顯示，補腎中藥能提高大鼠體內(nèi)促性腺激素釋放激素(gonadotropin －releasing hormone，GnRH)、黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和孕酮(progesterone，P)的水平，使子宮和卵巢重量增加，組織形態(tài)改善。說明補腎中藥對大鼠卵巢功能有改善作用[5－7]。六味地黃丸、金匱腎氣丸分別為調(diào)補腎陰、腎陽的經(jīng)典方劑，本項目擬從卵巢形態(tài)、卵巢內(nèi)分泌功能、卵巢相關(guān)抗體等方面的變化，觀察上述兩種不同補腎方法對化療后損害的卵巢功能是否具有修復作用，從現(xiàn)代醫(yī)學角度，進一步探討中醫(yī)“腎主生殖”的理論實質(zhì)。

材料和方法

1 藥物

六味地黃丸(組成:熟地黃、制山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓和澤瀉，每8丸相當于原生藥3 g)由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，國藥準字070426。金匱腎氣丸(組成:熟地黃、山藥、制山茱萸、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂枝、制附子、牛膝和車前子，每8丸相當于原生藥3 g)由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司提供，國藥準字Z11020147。

2 動物

純種SD大鼠，清潔二級，雌性，體重150～250 g，月齡2～4個月，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。動物合格證號為粵監(jiān)證字2008A002。

3 試劑

雌二醇(estrogen，E2)、FSH和抗卵巢抗體(antiovarian antibodies，AoAb)酶聯(lián)免疫試劑盒，由Rapid Bio生產(chǎn)。

4 儀器

酶標儀由Thermo Fisher Scientific生產(chǎn)，型號為Multiscan MK3。

5 方法

5.1 造模及給藥 60只大鼠隨機分為4組，給藥方法如下:A組:腹腔注射生理鹽水，每次每只動物2 mL，共15 d，之后生理鹽水灌胃，每次每只動物2 mL，連續(xù)灌胃28 d;B組:腹腔注射環(huán)磷酰胺(cytoxan，CTX)，第1 d腹腔注射12 mg，其后腹腔注射2 mg，連續(xù)14 d，其后生理鹽水灌胃，每次每只動物2 mL，連續(xù)灌胃28 d;C組:腹腔注射CTX，第1 d腹腔注射12 mg，其后腹腔注射2 mg，連續(xù)14 d，造模成功后，行六味地黃丸灌胃，每次每只動物2 mL，連續(xù)28 d;D組腹腔注射CTX，第1 d腹腔注射12 mg，其后腹腔注射2 mg，連續(xù)14 d，其后給予金匱腎氣丸灌胃，每次每只動物2 mL，共灌胃28 d。

5.2 檢測指標

5.2.1 HE染色 隨機選取一側(cè)卵巢，用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)石蠟包埋，切片，觀察卵巢大體形態(tài)。每只大鼠一側(cè)卵巢各取6張切片，在光學顯微鏡(100倍)下計數(shù)各級卵泡及黃體數(shù)量，取平均值。

5.2.2 血清內(nèi)分泌激素水平 取血并分離血清后，置－20℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法同批檢測血清中的性六項水平，具體步驟按試劑盒操作說明進行。

5.2.3 抗卵巢抗體檢測 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中AoAb表達。

6 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HE染色結(jié)果

從圖1、表1可見，青年對照組顯示卵巢內(nèi)各級卵泡及黃體數(shù)量豐富，形態(tài)正常，未見淋巴細胞浸潤(圖1A)，與模型組比較，差異顯著(P＜0.05，P＜0.01);模型組(圖1B)除閉鎖卵泡數(shù)量明顯高于其余各組外(P＜0.05，P＜0.01)，其它各級卵泡及黃體均明顯低于青年對照組，差異顯著(P＜0.01);治療后，補腎陰組及補腎陽組的原始卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、成熟卵泡及黃體數(shù)量均增加，而閉鎖卵泡數(shù)量降低，其中在原始卵泡、竇前卵泡的增加及閉鎖卵泡數(shù)量下降方面，補腎陰組優(yōu)于補腎陽組(圖1C、D)。

2 各組大鼠血清性激素的變化

模型組大鼠從給藥后第2 d起，E2水平即開始下降，與青年對照組比較，差異顯著(P＜0.05，P＜0.01);其后隨時間推移，模型組E2呈持續(xù)下降趨勢，而補腎方藥組E2下降較緩慢，尤其補腎陰E2下降速度慢于補腎陽組;造模組血清中FSH濃度持續(xù)升高，到造模第30 d，F(xiàn)SH升高較明顯，其中以模型組升高最明顯，補腎陰組FSH升高速度慢于補腎陽組，見表2。

Figure1.Histomorphological changes of the ovaries in rats from different groups(HE staining，×100).A:control group;B:CTX group;C:CTX+reinforcing the kidney－Yin group;D:CTX+reinforcing the kidney－Yang group.圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學變化

表1 各級卵泡及黃體HE染色結(jié)果Table1.The number of follicles in every stage and corpora lutea observed by HE staining

表2 各組大鼠不同時點血清E2和FSH的變化Table2.Serum FSH and E2levels in rats at different time points(.n=15)

表2 各組大鼠不同時點血清E2和FSH的變化Table2.Serum FSH and E2levels in rats at different time points(.n=15)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CTX group.

E2(ng/L)FSH(IU/L)Group 0 d 14 d 30 d 0 d 14 d 30 d Control 59.68 ±5.75# 59.30 ±5.02# 60.55 ±5.50# 0.15 ±0.03 0.15 ±0.20# 0.14 ±0.03#CTX 54.36 ±2.84▲ 45.82 ±3.23▲▲ 34.26 ±4.94▲▲ 0.26 ±0.29 0.25 ±0.03▲▲ 0.43 ±0.05▲▲CTX+reinforcing the kidney－Yin 53.46±4.02▲▲ 49.49±3.38▲▲ 51.65±4.75▲▲## 0.16±0.03 0.21±0.03▲▲# 0.19±0.03▲▲##CTX+reinforcing the kidney－Yang 53.97±3.30▲ 47.10±3.00▲▲ 42.65±2.85▲▲## 0.17±0.02 0.23±0.04▲▲ 0.40±0.02▲▲#

3 抗卵巢抗體變化情況

從表3可見，模型組AoAb明顯高于其余各組，差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)，應(yīng)用補腎藥后，AoAb明顯下降，但以補腎陰組下降明顯，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

討 論

本實驗旨在探討不同補腎方法對化療后卵巢功能損害防護作用的影響及機制。實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用化療藥物后，模型組卵巢內(nèi)各級卵泡及黃體數(shù)明顯下降，血清E2水平明顯下降，F(xiàn)SH水平明顯上升，血清抗卵巢抗體水平明顯升高，符合卵巢早衰的特征，造模成功，與文獻報道相符[8]。血清E2主要來源于卵巢顆粒細胞，是觀察卵巢儲備功能的直接指標。在對卵巢儲備的評價中，將血清E2與FSH水平結(jié)合起來，能夠很好地評價卵巢的儲備能力。本實驗分別采取滋補腎陰和溫補腎陽的方法對造模后大鼠進行干預，結(jié)果顯示，補腎陰組及補腎陽組在用藥后第30 d，E2水平均較模型組明顯上升，F(xiàn)SH數(shù)值均有所下降，但在補腎陰組下降較顯著。說明補腎方藥可以對化療所導致的卵巢功能損傷起到修復作用，增強卵巢儲備能力，尤其以補腎陰組效果明顯。用藥后兩組各級卵泡數(shù)及黃體數(shù)量均較模型組明顯增加，說明補腎方藥對卵巢功能保護作用機制可能是通過抑制顆粒細胞的凋亡、減緩卵泡的閉鎖，從而達到卵泡對CTX的敏感性降低的作用。

表3 各組抗卵巢抗體變化Table3.Comparison of serum AoAb level in rats from various groups()

表3 各組抗卵巢抗體變化Table3.Comparison of serum AoAb level in rats from various groups()

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CTX group.

Group n AoAb Control 10 0.79 ±0.06 CTX 9 1.68 ±0.08▲▲CTX+reinforcing the kidney－Yin 10 0.95 ±0.29▲##CTX+reinforcing the kidney－Yang 8 1.51 ±0.11▲▲#

抗卵巢抗體是一種位于卵巢顆粒細胞、卵母細胞、黃體細胞和間質(zhì)細胞內(nèi)的自身抗體。該抗體的產(chǎn)生原因尚不是很清楚，在感染、創(chuàng)傷、反復穿刺取卵或促排卵藥物的作用下，造成大量卵巢抗原釋放，刺激機體產(chǎn)生抗卵巢抗體?？孤殉部贵w可能通過阻礙卵母細胞成熟，使卵母細胞數(shù)量減少，影響雌孕激素的產(chǎn)生，降低卵巢的生殖內(nèi)分泌功能[9]。實驗結(jié)果顯示，補腎方藥可以使抗卵巢抗體表達下降，這可能是補腎方藥對卵巢功能保護作用的靶點之一，但其確切機制需要進一步探討。

化療在致病性質(zhì)上屬熱邪，由內(nèi)而散外，多傷及氣血、臟腑。化療后絕大多數(shù)病人表現(xiàn)為肝腎陰虛，以腎陰不足為主。特別是化療后期，氣陰兩傷，臨癥所見低熱、乏力、頭暈耳鳴、盜汗、腰膝酸軟、手足心熱、鼻衄、齒衄、口渴、便干、舌紅、苔少、脈細數(shù)，均為肝腎陰虛之證。卵巢為女性內(nèi)生殖器官，而“腎主生殖”，主宰著“腎－天癸－沖任－胞宮”之間的協(xié)調(diào)，使其“有子”或“無子”，故防止化療導致的卵巢功能損害應(yīng)從補腎，尤其是調(diào)補腎陰入手。本實驗結(jié)果證明補腎陰藥物對卵巢功能的保護作用優(yōu)于單純補腎陽，為以后指導臨床用藥提供了一定的指導意義。

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