HIF－1α基因沉默對大鼠肝癌CBRH－7919細胞p27和Ki67表達的影響*

許林鋒，倪嘉延，陳耀庭，孫宏亮，吳裕丹

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 1介入放射科，2血液科，廣東 廣州 510120)

缺氧誘導因子 1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF－1α)是由 Semenza等[1]于1992 年在缺氧誘導的細胞核抽提物中發(fā)現的一種重要的核轉錄因子。HIF－1由HIF－1α和HIF－1β 2個亞基組成，HIF－1α決定HIF－1的活性。HIF－1α在惡性腫瘤信號轉導通路中扮演重要的角色，是腫瘤細胞對缺氧適應反應的中心環(huán)節(jié)，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。p27蛋白為細胞周期的重要負性調控因子，可最直接地影響檢查點的調控，進而調控細胞的增殖活性[2]。Ki67蛋白是一種與細胞周期相關的增殖細胞核杭原，Ki67標記指數能可靠地反映正常和病變組織的增殖活性，對腫瘤的復發(fā)和轉移有預測作用[3]。本研究探討大鼠肝癌CBRH－7919細胞在缺氧環(huán)境下，HIF－1α基因沉默對p27和Ki67表達及細胞增殖的影響。

材料和方法

1 材料

大鼠肝癌細胞株CBRH－7919由中山大學實驗動物中心提供。RPMI－1640培養(yǎng)基購自Gibco;脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen;NC膜購自Pall;HIF－1α抗體購自Santa Cruz;p27和Ki67抗體購自CST;β－actin抗體購自博士德公司;TRIzol試劑購自TaKaRa;RT－PCR試劑盒購自TaKaRa;HIF－1α和β－actin引物用Primer 3軟件設計，由Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) CBRH－7919細胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)、傳代。將生長狀態(tài)良好的肝癌細胞消化下來以(8～10)×104/L密度接種于6孔板于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入150 μmol/L CoCl2溶液，用于模擬腫瘤內部缺氧環(huán)境。

2.2 HIF－1α siRNA載體的構建 根據前期實驗研究，選擇GenBank中大鼠HIF－1α基因編碼區(qū)序列作為分析序列。采用RNAdraw分析軟件對序列的二級結構進行預測，然后按照Elbashir等推薦的siRNA設計原則進行設計，并篩選出一條HIF－1α靶核苷酸序列(靶mRNA)。P1:5’－GAAACUCUUCCAAGCAAUUtt－ 3’，P2:5’ － AAUUGCUUGGAAGAGUUUCtt－3’，參照siRNA的基本設計原理選擇靶序列，針對目的基因的序列設計互補的siRNA表達載體核苷酸鏈，即HIF－1α siRNA特異性干擾序列。將siRNA溶液與脂質體LipofectamineTM2000載體試劑混合，形成siRNA/LipofectamineTM2000載體復合物。

2.3 細胞轉染 6孔板種植細胞(8～10)×104/L，在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細胞匯合度達到30% ～50%。將稀釋好的HIF－1α siRNA和脂質體LipofectamineTM2000載體試劑混合，形成 HIF－1α siRNA/LipofectaminTM2000復合物。將HIF－1α siRNA轉染載體加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中融合，然后放入37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，20 h恢復生長后，熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白的表達以檢測轉染效率。轉染分組:(1)空白對照組:僅加入LipofectamineTM2000試劑。(2)轉染組:轉染HIF－1α siRNA序列入細胞。

2.4 Real－time RT－PCR檢測 TRIzol法提取6孔板內各組細胞的總RNA并定量;各樣本取2 ng～2 μg總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA。應用real－time RT－PCR檢測，βactin作為內參照。PCR引物，HIF－1α正義鏈ACTGCACAGGCCACATTCAT，反義鏈CGAGGCTGTGTCGACTGAGA;β－actin正義鏈 CCTAGGCACCAGGGTGTGAT，β－actin反義鏈 TTGGTGACAATGCCGTGTTC。反應體系為20 μL總體系，反應條件95℃ 3 min預變性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線。

2.5 Western blotting檢測 冷PBS洗滌細胞2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收獲蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后，于100 V泳道進行SDS－PAGE;電泳結束后，以30 mA、120 min將蛋白轉移至NC膜;封閉液(5%BSA/TBST)封閉60 min，加入Ⅰ抗(1∶3000稀釋)4℃過夜，Ⅱ抗(1∶6000稀釋)室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次后用ECL試劑盒進行發(fā)光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡，并進行圖像分析。

2.6 流式細胞術檢測細胞周期 選擇對數生長期細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶收集處理后的細胞，800 r/min離心10 min，沉淀采用300 μL PBS重懸，逐滴加入700 μL預冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70%，4℃避光固定過夜。800×g離心10 min，去上清。PBS洗2次。重懸細胞于500 μL含1×105U/L RNase的PBS緩沖液中，避光，37℃孵育30 min。加2 g/L PI至終濃度50 mg/L，避光孵育30 min。流式細胞儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料用均數±標準差()表示，兩組間采用t檢驗，多個不同處理組組內、組間計量資料的比較應用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 缺氧條件下肝癌細胞HIF－1α的表達

CBRH－7919細胞經150 μmol/L CoCl2處理12 h后，HIF－1α mRNA表達量較常氧培養(yǎng)組顯著增高(P＜0.05);24 h后細胞HIF－1α mRNA相對表達量進一步增加(P＜0.05)，見圖1。CBRH－7919細胞HIF－1α蛋白的表達也呈顯類似規(guī)律，見圖2。

Figure1.Expression HIF－1α mRNA in hepatoma cells 24 h after treatment with CoCl2.A:real－time RT－PCR amplification curves of HIF－1α and β－actin under hypoxia;B:the change of HIF－1α mRNA expression in hepatoma cells..n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖1 肝癌細胞培養(yǎng)24 h后HIF－1α mRNA的表達

Figure2.Expression of HIF－1α protein in hepatoma cells treated with CoCl2for 24 h..n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 肝癌細胞HIF－1α蛋白的表達

2 siRNA干擾對HIF－1α表達的影響

在150 μmol/L CoCl2作用下，轉染HIF －1α siRNA表達載體后HIF－1α mRNA表達明顯減少，見圖3，同步檢測顯示，HIF－1α蛋白表達亦受到明顯抑制，見圖4，與對照組比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 沉默HIF－1α對p27表達的影響

150 μmol/L CoCl2處理和轉染 HIF －1α siRNA表達載體后，p27蛋白表達較未轉染HIF－1α siRNA表達載體的對照組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

Figure3.The change of the mRNA expression of HIF－1α after HIF－1α siRNA transfection.A:real－time RTPCR amplification curves of HIF －1α;B:the mRNA expression of HIF－1α..n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 HIF－1α siRNA干擾后肝癌細胞HIF－1α mRNA表達的變化

4 沉默HIF－1α對Ki67表達的影響

150 μmol/L CoCl2處理和轉染 HIF －1α siRNA表達載體后，Ki67蛋白表達較未轉染HIF－1α siRNA表達載體的對照組顯著減少，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

Figure4.The protein expression of HIF －1α，p27 and Ki67 after the transfection of HIF－1α siRNA..n=3.*P ＜0.05 vs control.圖4 HIF－1α siRNA干擾后HIF－1α、p27和Ki67蛋白表達的變化

5 沉默HIF－1α對肝癌細胞增殖的影響

流式細胞術結果顯示，HIF－1α siRNA轉染組各期細胞分布為:G0/G1期68.7%，S期17.5%，G2/M期13.8%，而未轉染siRNA表達載體的對照組各期細胞分布為:G0/G1期51.4%，S期32.7%，G2/M期15.9%。這表明HIF－1α siRNA能有效阻滯細胞于G0/G1期，進入S期的細胞數量明顯減少。統(tǒng)計學分析顯示，轉染組與對照組的G0/G1期和S期細胞比例差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，見圖5。

討 論

惡性腫瘤組織內部長期處于相對缺氧的微環(huán)境，可誘導HIF－1α的表達增加、降解減少。HIF－1α是腫瘤細胞對缺氧適應反應的中心環(huán)節(jié)，可上調多種靶基因的表達，使腫瘤對相對缺氧的微環(huán)境發(fā)生適應性改變。HIF－1α極不穩(wěn)定，易被蛋白酶降解，常氧條件下半衰期較短，但在缺氧時顯著延長[4]。

Figure5.Effect of HIF －1α silencing on cell cycle of hepatoma cells detected by flow cytometry.圖5 流式細胞術檢測HIF－1α siRNA干擾后肝癌細胞細胞周期的變化

根據以往學者相關研究經驗，應用siRNA干擾技術，轉染特異性siRNA于腫瘤細胞，可以有效沉默細胞中靶基因的表達。鑒于HIF－1α在惡性腫瘤細胞中的關鍵作用，本研究利用CoCl2建立缺氧模型，模擬腫瘤細胞內部相對缺氧的微環(huán)境，并轉染特異性HIF－1α siRNA于大鼠肝癌CBRH－7919細胞。結果顯示，缺氧環(huán)境下HIF－1α的表達顯著增加;特異性siRNA干擾腫瘤細胞后，HIF－1α和Ki67的表達明顯減少，p27的表達顯著增加。這表明沉默HIF－1α在顯著抑制Ki67表達的同時，明顯促進了p27的表達。于此同時，肝癌細胞的增殖亦受到一定程度的抑制。

RNA干擾可以形象地稱為基因沉默，是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制，屬于轉錄后基因沉默機制范疇[5]，能特異性地封閉一個或多個基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，減少非特異作用引起的副作用，是極富有前途的治療手段。目前采用特異性siRNA沉默HIF－1α，探討肝癌細胞中增殖相關因子表達變化的文獻報道尚不多見。本研究發(fā)現HIF－1α基因沉默后，增殖相關因子p27蛋白的表達明顯增多的同時Ki67蛋白的表達卻顯著減少。p27為細胞周期的重要負性調控因子，可最直接地影響限制點的調控，進而調控細胞的增殖活性。相關研究顯示p27的表達量和肝細胞肝癌的惡性程度及復發(fā)轉移密切相關[6－7]。Ki67是一種與細胞周期相關的增殖細胞核杭原，其標記指數能可靠的反映正常和病變組織的增殖活性，與肝細胞肝癌的病理特征及預后密切相關[8]。因此，沉默HIF－1α可能通過改變增殖相關因子的表達，使腫瘤細胞的增殖狀態(tài)亦發(fā)生改變。

HIF－1α在血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達的信號轉導通路中亦起著關鍵的作用。相關研究表明，HIF－1α在多個層次調節(jié) VEGF的表達，其主要功能包括增強VEGF的轉錄活性與增加VEGF mRNA穩(wěn)定性兩個方面[9]。VEGF是最早被發(fā)現的可被缺氧環(huán)境誘導生成并促進腫瘤新生血管生成的生長因子[10－11]。HIF－1α通過上調VEGF的表達，誘導腫瘤新生血管的生成，與腫瘤的復發(fā)、轉移密切相關。由此可見，利用siRNA干擾技術沉默腫瘤細胞HIF－1α的表達，可能對控制腫瘤的復發(fā)、轉移起到重要的作用。

本實驗研究尚存在著一定的局限性。應用特異性siRNA干擾技術沉默靶基因的表達，已有不少成功案例;但是截至目前為止siRNA干擾技術依然應用于離體實驗階段，在體動物實驗或臨床應用中，特異性siRNA干擾、沉默靶基因的功效如何，以及特異性siRNA載體的恰當選用，仍需要進一步的探索與證實。

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