原發(fā)性腎病綜合征并發(fā)急性腎損傷患者血清及腎組織中NGAL的表達(dá)及意義

劉 靜，李紹梅，薛 雯，溫文龍，楊 林，楊萬霞，王建榮

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)并發(fā)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)時(shí)臨床表現(xiàn)為無誘因出現(xiàn)少尿、無尿、腎功能急劇惡化;腎臟病理常出現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變?nèi)缂毙阅I小管壞死(acute renal tubular necrosis，ATN)。有些患者雖已出現(xiàn)ATN病理改變，但血肌酐仍然正常，依靠血肌酐常不能早期診斷急性腎損傷，故腎活檢是診斷ATN的金標(biāo)準(zhǔn)，而腎活檢是一項(xiàng)有創(chuàng)檢查并且具有一定風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找早期無創(chuàng)性和敏感性較好的AKI生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)PNS并發(fā)AKI的早期診斷、治療和改善預(yù)后有著重要意義。近年來已有大量研究表明中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL)是診斷急性腎損傷最有效的生物學(xué)標(biāo)志之一。本研究通過檢測(cè)PNS患者血清及腎組織中NGAL的表達(dá)水平，探討血清和腎組織NGAL在PNS合并AKI時(shí)的作用和臨床意義。

材料和方法

1 一般資料

選擇符合原發(fā)性腎病綜合征(診斷標(biāo)準(zhǔn):尿蛋白＞3.5 g/24 h，血漿白蛋白 ＜30 g/L)的患者72例(男45例，女27例)，年齡18～76歲，平均(37.47±18.61)歲，所有患者均行腎活檢病理檢查，除外繼發(fā)性腎病綜合征及感染性疾病。腎活檢前均未用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗凝劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等藥物。根據(jù)腎臟病理有無急性腎小管壞死分為2組:(1)原發(fā)性腎病綜合征合并急性腎小管壞死組15例(男8例，女7例)，其中微小病變(minimal change disease，MCD)合并急性腎小管壞死10例，系膜增生性腎炎(mesanginal proliferative glomerulonephritis，MsPGN)合并急性腎小管壞死5例;(2)原發(fā)性腎病綜合征不合并急性腎小管壞死組57例(男37例，女20例)，根據(jù)病理類型分為MCD組24例(男16例，女8例)，膜性腎病(membranous nephropathy，MN)組23例(均為Ⅰ期MN，男15例，女8例)，MsPGN組10例(男6例，女4例)。正常對(duì)照組:血標(biāo)本來自健康體檢者15例(男8例，女7例)，平均年齡(32.86±1.18)歲;腎組織為腎臟腫瘤切除術(shù)后患者的正常腎組織5例(男3例，女2例)，平均年齡(41.67±15.71)歲。

2 方法

2.1 標(biāo)本的采集和保存 (1)血標(biāo)本:收集入選患者腎活檢當(dāng)天清晨空腹靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，取上清液存于－70℃?zhèn)錂z。(2)腎組織標(biāo)本:在B超引導(dǎo)、無菌操作下腎活檢，標(biāo)本經(jīng)FAA復(fù)合固定液固定24 h，常規(guī)梯度濃度乙醇脫水，二甲苯中透明，浸蠟包埋，置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血清NGAL檢測(cè)方法 采用ELISA方法檢測(cè)血清NGAL的水平，ELISA試劑盒購于美國GBD公司。

2.3 腎組織免疫組化染色檢測(cè)NGAL表達(dá) 采用北航數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行病理圖像分析，在光學(xué)顯微鏡下放大200倍攝取圖像，每張切片任意選取5個(gè)不含有腎小球的皮質(zhì)視野，采用陽性目標(biāo)表達(dá)指數(shù)(expression index，EI)(%)=陽性目標(biāo)平均吸光度值×陽性面積/(陽性面積+陰性面積)×100%表示，取其平均值作為該切片的表達(dá)指標(biāo)。兔抗人NGAL多克隆抗體購于博海生物工程開發(fā)有限公司。

2.4 生化指標(biāo)測(cè)定 血尿素氮、血肌酐、血白蛋白和24 h尿蛋白定量采用Bayer ADVIA1650自動(dòng)生化儀在我院生化室檢測(cè);血β2微球蛋白采用放射免疫法在我院核醫(yī)學(xué)科檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較方差齊時(shí)采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，各組間兩兩比較選擇SNK法。NGAL與臨床指標(biāo)的相關(guān)性用直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PNS患者血清NGAL水平

PNS患者血清NGAL水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，PNS患者不同病理類型之間比較，MN組較MCD組、MsPGN組明顯升高(P＜0.05)，MCD組與MsPGN組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2 PNS患者腎組織NGAL的表達(dá)

PNS患者腎組織中NGAL陽性目標(biāo)表達(dá)指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，各病理類型之間NGAL表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

表1 PNS不同病理類型組患者血清NGAL水平和腎組織NGAL的表達(dá)Table1.The serum level and the renal expression of NGAL in PNS groups()

表1 PNS不同病理類型組患者血清NGAL水平和腎組織NGAL的表達(dá)Table1.The serum level and the renal expression of NGAL in PNS groups()

*P＜0.05 vs normal serum;△P＜0.05 vs MCD and MsPGN;#P＜0.05 vs normal renal tissue.

Group n Serum NGALRenal NGAL EI(μg/L)(%)MCD 24 67.75 ±21.94* 5.69 ±0.54#MN 23 92.67 ±29.83＊△ 5.47 ±0.66#MsPGN 10 73.72 ±24.06* 5.66 ±0.31#Normal serum 15 24.51 ±2.61 —Normal renal tissue 5 —3.16 ±0.69

3 PNS合并ATN與不合并ATN患者血清NGAL水平比較

MCD合并ATN組和MsPGN合并ATN組血清NGAL水平分別為(103.25±20.81)μg/L和(98.24±18.58)μg/L，明顯高于不合并ATN組[(67.75±21.94)μg/L和(73.72±24.06)μg/L，P ＜0.05]，見表2。

4 PNS合并ATN與不合并ATN患者腎組織NGAL表達(dá)比較

MCD合并ATN組和MsPGN合并ATN組腎組織NGAL的陽性目標(biāo)表達(dá)指數(shù)分別為(12.23±2.64)%和(14.68±3.80)%，明顯高于不合并ATN組[(5.69±0.54)%和(5.66±0.31)%，P ＜0.05]，見表2、圖1。

表2 MCD、MsPGN合并ATN組與不合并ATN組患者血清NGAL和腎組織NGAL水平的比較Table2.Comparison of the levels of NGAL in serum and renal tissues of PNS patents with or without ATN()

表2 MCD、MsPGN合并ATN組與不合并ATN組患者血清NGAL和腎組織NGAL水平的比較Table2.Comparison of the levels of NGAL in serum and renal tissues of PNS patents with or without ATN()

*P＜0.05 vs MCD without ATN and normol;#P＜0.05 vs MsPGN without ATN and normol.

Group n Serum NGAL(μg/L) Renal NGAL EI(%)Normal Serum 15 24.51±2.61─Renal 5 ─ 3.16±0.69 MCD With ATN 10 103.25±20.81* 12.23±2.64*Without ATN 24 67.75±21.94 5.69±0.54 MsPGN With ATN 5 98.24±18.58# 14.68±3.84#Without ATN 10 73.72±24.06 5.66±0.31

Figure1.NGAL expression in renal tissues(immunohistochemical staining，×100).A:normal renal tissue;B:MCD with ATN group;C:MCD group;D:MsPGN with ATN group;E:MsPGN group.圖1 腎組織NGAL的表達(dá)

5 相關(guān)分析結(jié)果

血清中NGAL與24 h尿蛋白定量、血尿素氮和血肌酐呈正相關(guān)(P＜0.05)，與血清白蛋白和β2微球蛋白無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。血中NGAL與腎組織NGAL的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.01)，見表3。

表3 血清NGAL與臨床指標(biāo)或腎組織NGAL的關(guān)系Table3.Correlation between serum NGAL and clinical parameters or the expression of NGAL in renal tissues

討 論

原發(fā)性腎病綜合征并發(fā)急性腎損傷病因復(fù)雜，可以發(fā)生在疾病的任何階段，各種病理類型均可發(fā)生，常發(fā)生于MCD和輕度MsPGN，但也可發(fā)生于其它病理類型如局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)，多數(shù)為少尿型，急性腎小管間質(zhì)損害是其病理學(xué)基礎(chǔ)，且早于血肌酐升高，嚴(yán)重者可危及生命[1]。本研究結(jié)果顯示72例腎病綜合征中以血肌酐升高診斷急性腎衰竭5例，占6.90%，但病理診斷合并急性腎小管壞死15例，占20.27%，其中MCD合并ATN 10例，占66.70%，系膜增生性腎小球腎炎合并ATN 5例，占33.30%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]。腎病綜合征合并急性腎損傷機(jī)制尚不完全清楚，可能是由于低蛋白血癥造成血容量不足，另外，白蛋白是尿蛋白的主要成分，可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖、凋亡或向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[3]，以及誘導(dǎo)表達(dá)一系列細(xì)胞因子，而且嚴(yán)重的蛋白尿可形成管型堵塞腎小管，腎間質(zhì)水腫壓迫腎小管導(dǎo)致其管腔狹窄、閉塞、造成腎小囊內(nèi)壓增高，而致腎小球?yàn)V過率進(jìn)一步下降出現(xiàn)急性腎衰竭。

目前血肌酐和尿量改變?nèi)允窃\斷急性腎損傷的依據(jù)，但血肌酐受年齡、性別、體重、容量負(fù)荷、肌肉代謝及蛋白攝入等非腎臟因素影響較大，結(jié)果并不可靠[4]，且血肌酐升高也不能反映腎臟損傷的部位，尿量更容易受到血容量狀態(tài)、藥物等非腎性因素影響。因此尋找早期的、敏感的、無創(chuàng)的標(biāo)志物至關(guān)重要。新近研究表明可反映急性腎損傷的生物學(xué)指標(biāo)有:半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、腎臟損傷分子－1、NGAL、白細(xì)胞介素－18、尿－N－乙酰－β－D氨基葡萄糖苷酶、Na+/H+交換體等，NGAL是診斷急性腎損傷最有效的生物學(xué)標(biāo)志之一。

NGAL是lipocalin家族的成員，NGAL蛋白由一條多肽鏈構(gòu)成，分子量為25 kD，含有178個(gè)氨基酸殘基，最早發(fā)現(xiàn)于粒細(xì)胞內(nèi)，與中性粒細(xì)胞明膠酶共價(jià)結(jié)合，目前的研究已經(jīng)證實(shí)NGAL蛋白可以運(yùn)輸疏水性小分子，參與細(xì)胞內(nèi)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。通常NGAL在人類一些組織(腎、肺、胃和結(jié)腸)中以很低的水平表達(dá)，在各種病理狀態(tài)下由免疫細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌，腎臟缺血或缺血性再灌注腎損傷后可引起小管升支粗段NGAL分泌迅速增加。NGAL不僅存在于尿液中，同樣也存在于血漿中，因此它既能避免因極度少尿帶來的麻煩，又能減輕因使用利尿藥治療等帶來的干擾，所以血漿中NGAL濃度的測(cè)定對(duì)少尿型AKI的早期診斷將更加有價(jià)值。在腎臟發(fā)育過程中，間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化受NGAL誘導(dǎo)，并且NGAL有類似轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)作用，主要被原始腎上皮細(xì)胞攝取，通過介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)來促進(jìn)腎上皮細(xì)胞的成熟。

張玉晶等[5]發(fā)現(xiàn)在過敏性紫癜患兒血清NGAL水平隨著尿蛋白排出增加而升高，大量蛋白尿組患兒血清NGAL水平明顯高于正常對(duì)照組。腎組織中NGAL的表達(dá)，大量蛋白尿組明顯高于正常對(duì)照組[6]。本研究結(jié)果中原發(fā)性腎病綜合征患者血清NGAL較正常對(duì)照組升高，并且與蛋白尿顯著相關(guān)，另外NGAL在正常腎組織及PNS患者腎組織近端腎小管上皮細(xì)胞胞漿均可表達(dá)，但在PNS患者腎組織中表達(dá)明顯升高，表明血清NGAL可反映蛋白尿?qū)е碌哪I小球損害，本研究結(jié)果顯示血清NGAL在腎病綜合征不同病理類型中以膜性腎病升高最明顯，可能與腎病綜合征不同病理類型蛋白尿發(fā)生機(jī)制不同有關(guān)，還有待于擴(kuò)大樣本量和臨床更進(jìn)一步研究證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)在腎缺血再灌注損傷后3 h就能檢測(cè)到NGAL，且在近端腎小管表達(dá)明顯增強(qiáng)[7]。有學(xué)者建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，分別在缺血前1 h、缺血中或缺血后1 h給予大鼠250 μg NGAL，與對(duì)照組相比，NGAL不但能夠明顯降低大鼠血尿素氮和血肌酐水平，而且明顯減少腎小管上皮細(xì)胞壞死，促進(jìn)腎小管上皮的修復(fù)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示原發(fā)性腎病綜合征合并急性腎小管壞死時(shí)血清及腎組織中NGAL表達(dá)水平較不合并急性腎小管壞死時(shí)明顯升高，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，說明血NGAL的增高不僅可反映腎小球損害，還可以預(yù)測(cè)急性腎小管壞死，能夠作為診斷早期急性腎損傷的敏感生物學(xué)指標(biāo)。在腎臟受損后，近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)NGAL增多，其可以減少局部白細(xì)胞的聚集和活化，介導(dǎo)進(jìn)入其中的中性粒細(xì)胞凋亡，減輕炎癥細(xì)胞的侵害，從而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的再生。

有文獻(xiàn)[10]報(bào)道心臟介入術(shù)后發(fā)生AKI的患者在手術(shù)后1～2 h血NGAL濃度明顯升高，比血肌酐明顯升高要早48～72 h，血中NGAL檢測(cè)特異度為74%，敏感度達(dá)90%。最近有報(bào)道顯示在一項(xiàng)前瞻性研究中，患者均為接受選擇性心臟手術(shù)的兒童，這些兒童的腎功能是正常的，但在手術(shù)后2～3 d，30%的研究對(duì)象發(fā)生了 AKI(界定血肌酐增加50%)[11]。在ICU患者發(fā)生AKI的48 h內(nèi)，血漿NGAL是一個(gè)很好的預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且與 AKI的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12]。Di Grande等[13]利用蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在腎缺血和毒性動(dòng)物模型中，NGAL是最早被發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)的蛋白質(zhì)之一，血中的NGAL水平升高可在血肌酐升高前48 h出現(xiàn)，并與肌酐濃度呈正相關(guān)。

本研究表明血NGAL與24 h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐呈正相關(guān)，對(duì)PNS合并ATN 15例患者的分析得出:100%血NGAL水平增高，但僅有約23%血肌酐升高，48%β2－MG升高，說明血NGAL升高早于傳統(tǒng)腎功能的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)診斷早期AKI時(shí)比肌酐更有價(jià)值。

綜上所述，檢測(cè)血清NAGL的水平有助于腎病綜合征合并急性腎損傷的早期診斷，具有無創(chuàng)性，較傳統(tǒng)的腎功能指標(biāo)具有更早、敏感性更高的優(yōu)點(diǎn)，更適用于少尿性AKI，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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