胃癌患者p16基因啟動(dòng)子甲基化檢測及其臨床意義

楊羅庭，徐 偉，劉壽行，吳一中，劉 鵬

(1沅江市人民醫(yī)院，湖南沅江 413000;2湖南省人民醫(yī)院)

p16基因是一種重要的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控基因，抑制細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是重要的抑癌基因。研究表明，p16基因的失活與胃癌的分化、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。其失活機(jī)制有突變、缺失和甲基化3種。其中前兩種機(jī)制僅在不到10%的腫瘤中發(fā)生，而啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化是p16基因失活的主要原因，可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞中p16蛋白表達(dá)缺失，同時(shí)也是胃癌發(fā)生過程中的早期事件［1，2］。2005年1月～2010年12月，我們檢測了58例胃癌患者癌組織中p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，旨在探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系及在胃癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 58例行胃癌根治術(shù)的患者，男30例，女28例;年齡38～67歲。其中高中分化腺癌26例，低分化腺癌32例;腫瘤直徑＜3 cm 39例，≥3 cm 19例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無淋巴結(jié)注意23例;所有病例術(shù)前均未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。留取手術(shù)切除的胃癌變組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，另收集30例健康體檢者胃黏膜(胃鏡取材)作為正常對(duì)照。所有標(biāo)本取材均經(jīng)患者及家屬的同意并簽署知情同意書。

1.2 p16基因啟動(dòng)子CpG島甲基化檢測 NA提取及MSP引物設(shè)計(jì):按臨床樣本DNA提取試劑盒(上海生工)說明書提取DNA，提取的基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測其完整性，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測 A260/A280 為 1.8 ～2.0。取 45 μL DNA 用0.2 mol/L NaOH變性處理，向變性DNA中加入新鮮配制的10 mmol/L氫醌30 μL及36 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，樣品混勻后置于55℃水浴20 h。處理后的DNA用Wizard DNA Purification Systems試劑盒(Promega公司提供)純化后，溶入50 μL三蒸水中立即使用或放入－20℃冰箱備用。MSP引物參照文獻(xiàn)［3，4］設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化引物(見表1)，由大連寶生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)在AB9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體積20 μL，2×Hotstart PCR Master Mix 10 μL，模板 2 μL(約 30 ng)，上下游引物(10 pmol/l)各 1 μL，加水至 20 μL，混勻后稍離心。反應(yīng)條件如下:甲基化特異性的p16基因引物:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65 ℃退火30 s，循環(huán)35 次，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物4℃保存。未甲基化特異性的p16基因引物:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，循環(huán) 35 次，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，生物素Goldview染色，紫外燈下觀察結(jié)果并照相。分析p16基因甲基化與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或者Fisher精確檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p16基因甲基化表達(dá) 58例胃癌組織標(biāo)本中，26例(44.8%)在p16基因啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)異常甲基化;58例癌旁組織標(biāo)本中，5例(8.6%)在p16基因啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)異常甲基化。30例正常胃黏膜組織標(biāo)本未檢測到甲基化的存在(P均＜0.05)。

2.2 p16基因甲基化和臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 p16甲基化與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化導(dǎo)致其功能失活是其參與腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，也是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。p16基因甲基化現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)于肺癌、肝癌及結(jié)腸癌等各種不同的癌標(biāo)本及腫瘤細(xì)胞株中，該基因甲基化可能是導(dǎo)致p16表達(dá)下調(diào)或無表達(dá)的主要原因之一。Jang等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，p16抑癌基因啟動(dòng)子超甲基化也是胃癌發(fā)生中的早期常見事件。p16基因位于人類染色體9p21區(qū)，其主要作用是在“cyclinD1-CDK4-PRb-ERF”環(huán)路中其負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，p16基因的任何變異都會(huì)導(dǎo)致上述環(huán)路無限制地進(jìn)行，細(xì)胞過度增殖，使G1期未充分發(fā)育的細(xì)胞提前進(jìn)入S期，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［6］。本研究結(jié)果表明p16啟動(dòng)子CpG島甲基化率:胃癌組織＞癌旁組織＞正常組織，胃癌組織甲基化率為 44.8%，與國外報(bào)道［7，8］基本一致。由于在胃癌癌旁黏膜中常發(fā)生腸上皮化生、慢性萎縮性胃炎、異型增生等癌前病變，故本研究對(duì)胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織甲基化狀態(tài)均進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示胃癌組織甲基化率顯著高于癌旁組織及正常胃黏膜組織，說明p16啟動(dòng)子CpG島甲基化不僅參與了胃癌的發(fā)生而且與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者p16基因甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤大小及浸潤深度無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。即發(fā)現(xiàn)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織p16基因的異常甲基化顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示p16基因異常甲基化與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為判斷胃癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。

總之，對(duì)可疑胃癌組織的p16基因啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化檢測，再結(jié)合胃鏡、病理學(xué)及其它一些實(shí)驗(yàn)手段，有望提高胃癌的早期檢出率。在此基礎(chǔ)上隨著甲基化抑制因子去甲基化治療的臨床應(yīng)用進(jìn)一步發(fā)展，可望為胃癌的治療開辟新途徑。

［1］Kanyama Y，Hibi K，Nakayama H，et al.Detection of p16 promoter hypermethylation in serum of gastric cancer patients［J］.Cancer Sci，2003，94(5):418-420.

［2］Bae SC，Choi JK.Tumor suppressor activity of RUNX3［J］.Oncogene，2004，23(24):4336-4340.

［3］Luo D，Zhang B，Lv L，et al.Methylation of CpG islands of p16 associated with progression of primary gastric carcinomas［J］.Lab Invest，2006，86(6):591-598.

［4］Herman JG，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(18):9821-9826.

［5］Jang TJ，Kim DI，Shin YM，et al.p16(INK4a)Promoter hypermethylation of non-tumorous tissue adjacent to gastric cancer is correlated with glandular atrophy and chronic inflammation［J］.Int J Cancer，2001，93(5):629-634.

［6］Ohtani N，Yamakoshi K，Takahashi A，et al.The P16INK4a-RB pathway:molecular link between cellular senescence and tumor suppression［J］.J Med Invest，2004，51(3-4):146.

［7］Shim YH，Kang GH，Ro JY.Correlation of p16 hypermethylation with p16 protein loss in sporadic gastric carcinomas［J］.Lab Invest，2000，80(5):689-695.

［8］Ding Y，Le XP，Zhang QX，et al.Methylation and mutation analysis of p16 gene in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2003，9(3):423-426.