羅格列酮對阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征小型豬脂肪組織IL-6表達(dá)的影響

湯鳳蓮，周 燕，解培順 ，于冉冉，于會(huì)娜

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 541001;2梁山縣人民醫(yī)院)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAHS)發(fā)病率高、具有潛在危險(xiǎn)。肥胖和高胰島素血癥是OSAS主要發(fā)病因素之一。羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是有效的核轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)的激動(dòng)劑。作為一種新型的胰島素增敏劑，具有拮抗胰島素抵抗、降低高血糖、改善脂代謝紊亂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。補(bǔ)充研究時(shí)間?，我們觀察了羅格列酮對脂肪組織IL-6表達(dá)及高胰島素血癥、胰島素抵抗的影響，探討其治療OSAHS的可行性及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性清潔級中國小型豬18只(購自廣西大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量是(25±2.2)kg;醫(yī)用冰袋(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司);TAq酶(北京天根生物公司);IL-6 mRNA引物(上海英駿生物公司);兔抗豬IL-6一抗(博士德公司)。多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀1臺(tái)(美國泰科公司生產(chǎn));Legendmiro 17R型微量臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司);Biometra型PCR擴(kuò)增儀(德國耶拿分析儀器股份公司);JS-780型全自動(dòng)凝膠成析系統(tǒng)(上海培清科技);酶標(biāo)儀(Labsystem MK3，芬蘭);EPS 301型SDS-PAGE電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech公司);SD轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及干預(yù) 雌性清潔級中國小型豬18只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、羅格列酮組各6只。參照徐斌［1］等方法制作OSAHS模型，手術(shù)當(dāng)天禁食、禁水，采用苯巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，連接多導(dǎo)睡眠儀，采用金屬注射器抽取醫(yī)用冰袋內(nèi)凝膠狀物8 mL和80萬U青霉素溶液防止局部感染，于動(dòng)物雙側(cè)咽腭部及舌根部多點(diǎn)進(jìn)針，緩慢注射，直至動(dòng)物出現(xiàn)鼾聲、多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀上觀察到典型的呼吸暫停圖形時(shí)即停止注射，以平均呼吸暫停次數(shù)(AI)≥30次或睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)≥5次/h為造模成功指標(biāo);對照組咽腭部及舌根部注射等量生理鹽水。制模成功后治療組喂服羅格列酮4 mg/(kg·d)，對照組與模型組喂服等量生理鹽水。每組動(dòng)物均在術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后2周及處死前行多導(dǎo)睡眠儀監(jiān)測動(dòng)物的睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)、最低血氧飽和度(SaO2)。干預(yù)12周后處死各組動(dòng)物并取大網(wǎng)膜脂肪組織，分別用DEPC水與無菌冰生理鹽水沖洗并剪成0.5 g大小的脂肪塊，分裝在無菌EP管中密封，迅速液氮冷凍，－80℃保存，DEPC水沖洗過的留做RT-PCR，生理鹽水沖洗過的留做蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western blot方法)。

1.2.2 觀察項(xiàng)目

1.2.2.1 睡眠生理指標(biāo) 采用多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀監(jiān)測各組平均呼吸暫停次數(shù)(AI)、睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)及最低血氧飽和度(SaO2);

1.2.2.2 血清相關(guān)指標(biāo) 各組麻醉后抽取耳緣靜脈血5 mL，5 000 r/min離心10 min分離血清，空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法，胰島素、胰島素原采用放射免疫(RIA)法，采用HOMA模型公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=(胰島素 ×血糖)/22.5。

1.2.2.3 肪脂組織IL-6mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法:將超低溫凍結(jié)的大網(wǎng)膜脂肪組織迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研棒研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，取研磨成粉末狀的樣品100 mg加入到含有1 mL RNAiso plus的2 mL EP管中，輕搖混勻，置于冰浴上勻漿5 min，12 000轉(zhuǎn)4℃離心5 min;加入200 μL氯仿，震蕩混勻，冰浴上靜置5分鐘，4℃、12 000 r/min離心15 min;將上清液移至新的1.5 mL EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇，冰浴上靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min;棄上清保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇，4℃、12 000 r/min離心5 min;棄上清保留沉淀，干燥;溶解于30～50 μL DEPC處理水中。用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度。總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA各取1 μg RNA按試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μL cDNA為模板，分別以IL-6的引物(上游引物5'-TCCAGACCCTGAGGCAAAAGGGA-3';下游引物5'-TGCCCGTGGACGGCATCAAT-3';擴(kuò)增片段約220 bp)與內(nèi)參照 β-action的引物(上游引物5'-GCTAGTCTCCAAGCGACGAA-3';下游引物5'-TACAGTCTAAAACTTTTGCCCTT-3'，擴(kuò)增片段約319 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在含有0.5 μg/mL溴已啶的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物條帶用凝膠成像系統(tǒng)照相并進(jìn)行灰度分析。目的片段的相對表達(dá)量=目的基因的灰度值/β-action的灰度值。

1.2.2.4 脂肪組織IL-6蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法。提取各組脂肪組織總蛋白，用BSA試劑盒測定總蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)本蛋白濃度計(jì)算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致;行 SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上;將膜用5%的脫脂奶粉封閉后，加入抗IL-6單克隆抗體(稀釋度1∶500)，室溫孵育1 h;洗膜后加入二抗鼠抗兔IgG(稀釋度1∶1 000)室溫孵育1 h;PBST充分洗滌后，用化學(xué)發(fā)光顯影藥盒顯影，X線膠片曝光記錄影像;凝膠成像分析系統(tǒng)分析膠片，讀取各目的條帶及β-action的光密度值，計(jì)算其比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料比較t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用方差分析和q檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睡眠生理指標(biāo) 見表1。

表1 三組睡眠生理指標(biāo)比較(n=6，±s)

表1 三組睡眠生理指標(biāo)比較(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05

組別 AI(次/h) AHI(次/h) 最低SaO2(%)治療組 14.33 ±1.37＊△ 20.17 ±1.47＊△ 78.89 ±1.03＊△模型組 17.50 ±1.87* 23.00 ±1.41* 75.69 ±0.58*對照組2.35 ±0.10 3.13 ±0.20 89.60 ±2.75

2.2 血清學(xué)指標(biāo) 見表2。

表2 三組血清學(xué)指標(biāo)比較(n=6，±s)

表2 三組血清學(xué)指標(biāo)比較(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)胰島素(pmol/L)胰島素原(pmol/L)HOMA-IR治療組 7.50 ±0.75▲△ 4.78 ±0.71▲△ 0.44 ±0.04▲△ 1.59 ± 0.25▲△模型組 11.94 ±2.51*103.18 ±6.20* 9.49 ±1.03* 54.97 ±13.09*對照組5.33 ±0.71 3.70 ±0.51 0.37 ±0.64 0.88 ± 0.13

2.3 IL-6mRNA及IL-6蛋白表達(dá) 見表3及圖1、圖2。

表3 三組IL-6mRNA及蛋白比較(n=6，±s)

表3 三組IL-6mRNA及蛋白比較(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

組別 IL-6mRNA IL-6蛋白治療組 0.86±0.05▲△ 0.82±0.05▲△模型組 1.20 ±0.03* 1.23 ±0.10*對照組0.41 ±0.08 0.73 ±0.06

圖1 各組脂肪組織IL-6 mRNA表達(dá)

圖2 各組脂肪組織IL-6蛋白表達(dá)

3 討論

OSAHS的病理生理學(xué)相當(dāng)復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其有效的治療方法是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)，肥胖和高胰島素血癥是OSAHS主要發(fā)病環(huán)節(jié)之一。脂肪細(xì)胞因子在胰島素抵抗以及代謝綜合征組分疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，IL-6是近年研究熱門的一種脂肪源性細(xì)胞因子，是肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗聯(lián)系的關(guān)鍵［2，3］。是否可通過調(diào)節(jié)OSAS患者體內(nèi)IL-6水平而改善OSAS患者 AHI、AI、HI、最低血氧飽和度等指標(biāo)，從而改善臨床癥狀是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)思路，目前國內(nèi)外此方面的探討很少。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，具有廣泛生物學(xué)活性，在機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、造血調(diào)控和腫瘤免疫中起重要作用。它的失調(diào)與多種臨床疾病有關(guān)。IL-6代謝紊亂可能是一個(gè)影響OSAHS發(fā)生、發(fā)展的因素。近幾年關(guān)于IL-6與OSAHS間關(guān)系的研究多集中在IL-6作為炎癥介質(zhì)或氧化應(yīng)激標(biāo)記物在體內(nèi)的變化，IL-6主要由免疫細(xì)胞分泌［4］。最近研究表明，脂肪組織等非免疫細(xì)胞亦可產(chǎn)生IL-6，在脂質(zhì)化物代謝中發(fā)揮重要作用。IL-6是受激素調(diào)節(jié)的脂肪細(xì)胞因子，腎上腺皮質(zhì)激素和雌激素可抑制其產(chǎn)生，而兒茶酚胺可刺激其生成。OSAHS患者AHI增加，夜間血氧飽和度下降，進(jìn)而引起交感神經(jīng)興奮、兒茶酚胺類物質(zhì)升高、血壓波動(dòng)，這些均可導(dǎo)致IL-6水平升高。近來，發(fā)現(xiàn)IL-6對生理睡眠有調(diào)節(jié)作用，可減少動(dòng)眼睡眠、改變慢波睡眠，使人嗜睡、易疲乏，注意力不集中。王曾等［5］發(fā)現(xiàn)OSAHS患者血漿IL-6水平較正常對照組明顯升高，且與病情呈正相關(guān)。另外，Kopp等［6］發(fā)現(xiàn)IL-6與胰島素抵抗顯著相關(guān)，可引起肥胖相關(guān)的胰島素抵抗。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，噻唑烷二酮類藥物可通過調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等脂肪細(xì)胞因子的水平而增強(qiáng)胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗［7］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予羅格列酮干預(yù)后觀察對脂肪源性細(xì)胞因子IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)模型組與對照組比較AI、AHI升高，最低血氧飽和度SaO2下降，符合OSAHS患者的診斷標(biāo)準(zhǔn);同時(shí)血糖、胰島素、胰島素原、HOMA-IR等指標(biāo)均升高，提示OSAS存在高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗等并發(fā)癥;模型組與對照組比較脂肪組織IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)灰度值均升高，提示OSAS可導(dǎo)致IL-6水平升高。治療組與模型組比較IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)灰度值均降低，血糖、胰島素、胰島素原、HOMA-IR、AI、AHI均降低，SaO2升高。提示羅格列酮可能通過減輕胰島素抵抗，降低脂肪組織IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮其對OSAS的干預(yù)作用，降低OSAS疾病并發(fā)癥的發(fā)生率。

綜上所述，羅格列酮對OSAHS有治療作用，其機(jī)制可能為減輕胰島素抵抗，降低IL-6 mRNA及IL-6蛋白表達(dá)。

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