美洲大蠊提取物誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡及作用機(jī)制

董京千，偉忠民，王 晶

(1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121000;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

美洲大蠊屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂。用于藥物始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明美洲大蠊具有促進(jìn)傷口愈合、組織修復(fù)作用;增強(qiáng)免疫、抗腫瘤作用;抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒作用;強(qiáng)心升壓、改善微循環(huán)作用［2］。近年來(lái)，人們對(duì)美洲大蠊藥用價(jià)值的研究越來(lái)越多，但有關(guān)美洲大蠊對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究少有報(bào)道。2011年2月～2012年2月，我們觀察了美洲大蠊對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖及凋亡作用的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。美洲大蠊(綿陽(yáng)好醫(yī)生中藥飲片有限公司，順鉑(云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司);DMEM培養(yǎng)基干粉購(gòu)自GIBCO公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季清生物制品公司，胰蛋白酶購(gòu)自Hyclcome公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Amresco公司)，AncxinV-FITC凋亡試劑盒(北京賽寶生物公司)，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。電子天平(北京塞多利斯天平有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)，超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Sheldon Manufacturing IncUSA)，超凈工作臺(tái)(江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所)，TDL-4型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，XD-101型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊提取物制備 美洲大蠊40 g加入15倍量95%乙醇，3次冷浸提取，合并乙醇提取液，濾過(guò)，減壓濃縮回收乙醇，石油醚脫脂得提取浸膏［3］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中用含10%小牛血清和DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化傳代，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［4］。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù)及增殖抑制率(IR)檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以DMEM完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。所有細(xì)胞隨機(jī)分為三組，觀察組接種到96孔板中，置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入100 μL含有不同濃度的美洲大蠊提取物(DMEM培養(yǎng)基稀釋)，每種濃度設(shè)5個(gè)平行孔，終濃度分別為 300、100、33.3 μg/mL。順鉑組加入順鉑20 μg/mL作用于細(xì)胞48 h，常規(guī)收集細(xì)胞，PBS洗滌，重懸調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/mL。對(duì)照組只加入培養(yǎng)基。分別置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸除上清，每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床上震蕩20 min使紫色結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處A值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算IR。IR=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.4 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞分組及處理同1.2.3。AncxinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行，加入5 μL AncxinV-FITC和5 μL PI輕輕混勻，25℃鋁箔避光孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)經(jīng)Bioconsort專用軟件處理，分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞線粒體膜電位測(cè)定 細(xì)胞分組及處理同1.2.3。按照J(rèn)C-1染色試劑盒操作說(shuō)明經(jīng)行，加入JC-1染色劑，使其終濃度為10 μg/mL。JC-1染色緩沖液洗滌2次，PBS重懸，進(jìn)行流式檢測(cè)與分析線粒體膜電位變化。

1.2.6 細(xì)胞干預(yù)及Caspase-3活性檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞，消化接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入實(shí)驗(yàn)組美洲大蠊提取物，終濃度分別為300、100、33.3 μg/mL，對(duì)照組加入順鉑 20 μg/mL 作用于細(xì)胞48 h，消化，離心，PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸細(xì)胞使細(xì)胞濃度至5×106/mL。按照Caspase-3試劑盒說(shuō)明操作，加入 Ac-DEVD-pNA 10 μL，上酶標(biāo)儀405 nm處檢測(cè)Caspase-3活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IR 見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)A值及IR比較

2.2 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞Caspase-3活性 見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞Caspase-3活性比較(±s)

表2 各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞Caspase-3活性比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡率(%) Caspase-3活性(A值)觀察組33.3 μg/mL 12.34 ±0.98* 0.164 ±0.057*100 μg/mL 18.67 ±1.23* 0.237 ±0.039*300 μg/mL 26.38 ±1.14* 0.319 ±0.040*順鉑組 13.88 ±1.67* 0.086 ±0.032對(duì)照組1.56 ±0.86 0.082 ±0.012

2.3 細(xì)胞線粒體膜電位 各組細(xì)胞線粒體膜電位見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，美洲大蠊提取物可以使細(xì)胞線粒體膜電位下降。隨著美洲大蠊提取物濃度的升高，細(xì)胞線粒體膜電位逐漸下降并呈現(xiàn)劑量依賴性，與對(duì)照組相比，P＜0.05。

圖1 美洲大蠊提取物對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

3 討論

肝癌惡性程度高，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，生存率低。放化療為肝癌目前的主要治療手段，但有明顯的毒副作用?，F(xiàn)代藥理研究表明中醫(yī)藥在防治肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，提高生活質(zhì)量以及特有的低毒，整體調(diào)節(jié)方面的綜合優(yōu)勢(shì)。但是由于中藥的化學(xué)成分及作用機(jī)制仍然不十分明確，阻礙了進(jìn)一步的研究和利用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生物體內(nèi)的一個(gè)重要的生命現(xiàn)象，肝癌的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖失衡有密切關(guān)系，癌細(xì)胞調(diào)亡減少導(dǎo)致肝癌迅速生長(zhǎng)。中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的新途徑［5］。

國(guó)內(nèi)外研究表明，美洲大蠊提取物體外能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。蔣永新等［6］研究表明美洲大蠊提取物有阻滯胃癌細(xì)胞周期抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。美洲大蠊提取物作用于BGC-823細(xì)胞可使G2/M期細(xì)胞聚集，阻滯M/G1細(xì)胞轉(zhuǎn)換，S期細(xì)胞減少，干擾癌細(xì)胞DNA合成。細(xì)胞內(nèi)外的許多因素可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。雖然這些因素和傳導(dǎo)途徑不同，但是細(xì)胞凋亡后期具有相同的Caspase激活。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要核心通路有線粒體依賴性細(xì)胞通路和配體受體激活的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路。細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體通透性發(fā)生變化，線粒體腫脹，線粒體跨膜電位下降，ATP合成抑制，線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子及細(xì)胞色素C，通過(guò)不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生具有活性的 Caspase-9再激活下游Caspase-3等效應(yīng)Caspase，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡［7］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，美洲大蠊提取物抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，線粒體膜電位逐漸下降，Caspase-3蛋白被活化。提示線粒體途徑可能是美洲大蠊提取物誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一，但具體的凋亡作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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