雌激素對高糖誘導的HepG2細胞ACAT2表達的影響

張聞宇，張素華，李 蓉，龔莉琳

(1鄭州市人民醫(yī)院，鄭州 450003;2重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

絕經(jīng)后女性心血管事件發(fā)病率明顯升高，而接受雌激素治療后冠脈鈣化的程度明顯減輕［1］。雌激素對血脂和脂蛋白濃度均產(chǎn)生有益的影響，對動脈粥樣硬化有預防作用，但其機制十分復雜，可能部分與調節(jié)肝臟膽固醇代謝有關。酰基輔酶A∶膽固醇?；D移酶(ACAT)是廣泛存在于真核細胞中的一種膜結合酶，能催化膽固醇與長鏈脂肪酸連接生成膽固醇酯，參與膽固醇的代謝，其包括ACAT1和ACAT2兩種同工酶，ACAT2主要存在于肝細胞中［2］。已證實ACAT2活性升高與動脈粥樣硬化程度密切相關，而雌激素預防動脈粥樣硬化的作用也與其調節(jié) ACAT2的活性有關［3］。2011～2012年，我們觀察了雌激素對高糖誘導人HepG2細胞ACAT2表達的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 17-β雌二醇購于 Sigma公司;HepG2細胞由第三軍醫(yī)大學生物化學教研室提供;DMEM購于Gibco公司;兔抗人ACAT2多克隆抗體DM54由TaYuan Chang博士惠贈;辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司;SuperscriptⅡ逆轉錄酶、lipofectamine2000購于 Invitrogen公司;Tripure購于Roche公司;PVDF膜購于美國Bio-Rad公司;實驗中部分引物用Primer premier5.0軟件設計，由上海生工生物技術公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將 HepG2細胞置于DMEM(低糖)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內，以0.7×106/L接種六孔培養(yǎng)板內過夜培養(yǎng)后，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將細胞分為四組，對照組加入正常培養(yǎng)基，甘露醇組加入終濃度為25 mmol/L甘露醇溶液，高糖組加入的葡萄糖溶液培養(yǎng)基孵育12 h;雌激素組用含總濃度25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基與細胞孵育4 h后，再加入終濃度為1×10－8mol/L 17β-雌二醇孵育8 h。

1.2.2 ACAT2 mRNA檢測 采用 RT-PCR法。常規(guī)方法提取HepG2細胞總RNA，進行逆轉錄，按照SuperscriptⅡ說明書完成。取 cDNA 2 μL，PCR 擴增目的片段。其中ACAT2采用巢式PCR擴增，擴增條件為:94℃預變性15 min;94℃變性30 s，退火56℃(ACAT2第一輪)/58℃(ACAT2第二輪)/57℃(β-actin)，30 s;延伸 72 ℃、30 s;28cycle(β-actin)/30cycle(ACAT2);后延伸 72℃、10min。ACAT2第一輪上游引物5'-TTTCTCCAGCTACCTCTAC-3'，下游引物 5'-ATGACGGGATAGAAGAACC-3';ACAT2第二輪上游引物5'-CCTAGGACGCCCTATGTCAG-3'，下游引物 5'-GGACGTTGAGTTCCACCAGT-3'，擴增片段長度為300bp。β-actin上游引物5'-TCCCTCAAGATTCTCAGCA-3'，下 游 引 物 5'-ACATCCACAACGCATACA-3'，擴增片段長度為293 bp。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠鑒定。ACAT2 mR-NA與同組β-actin mRNA擴增條帶光密度比值即為ACAT2 mRNA相對表達水平。

1.2.3 ACAT2蛋白檢測 采用 Western blotting法。提取細胞總蛋白(操做方法見說明書)后取50 μg進行SDS-PAGE(10%)電泳。電泳完畢半干式轉移(13 V，1 h)至PVDF膜上，4℃封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜(ACAT2 1∶100)，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。DAB顯色。ACAT2與同組GAPDH條帶光密度比值即為ACAT2蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組ACAT2 mRNA及蛋白表達見圖1、圖2;其表達水平見表1。

圖1 ACAT2 mRNA表達

圖2 ACAT2蛋白表達

表1 各組ACAT2 mRNA及蛋白表達水平(±s)

表1 各組ACAT2 mRNA及蛋白表達水平(±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.001;與高糖組相比，#P ＜0.001

組別 ACAT2 mRNA ACAT2蛋白雌激素組 0.492 ±0.007# 0.745 ±0.031#高糖組 0.759 ±0.007* 0.873 ±0.020*甘露醇組 0.506 ±0.005 0.531 ±0.027對照組0.502 ±0.001 0.537 ±0.021

3 討論

女性絕經(jīng)后體內雌激素減少導致的胰島素抵抗是心血管疾病和2型糖尿病(DM)在絕經(jīng)后女性發(fā)病率增加的中間環(huán)節(jié)［4］。絕經(jīng)后女性TC、TG、LDLC升幅和高脂血癥患病率高于同年齡段男性，表明雌激素水平的降低是導致血脂升高的一個重要因素。

ACAT2是一種可被誘導表達的酶，主要分布于肝臟和小腸。正常情況下成人肝臟ACAT2的活性較低［5］。肝細胞ACAT2催化生成的膽固醇酯是構成新合成VLDL的脂核所必需。高膽固醇喂飼的動物，冠狀動脈發(fā)生AS的程度與肝中的膽固醇酯的數(shù)量呈正相關，提示ACAT2的低活性對機體具有保護作用［6］。ACAT2的活性主要隨基因轉錄和翻譯的變化而改變［2］。本研究中高糖組 ACAT2 mRNA和蛋白的表達升高，部分解釋了2型DM易出現(xiàn)血脂異常的可能原因。

Galipeau等［7］研究發(fā)現(xiàn)，高果糖喂養(yǎng)的去勢雌性大鼠空腹血糖、血壓均升高;而雌激素替代的同時高果糖喂養(yǎng)的去勢雌性大鼠卻未出現(xiàn)血糖、血壓升高等代謝綜合征的表現(xiàn)。表明雌激素能夠抑制高果糖飲食所誘導的空腹血糖升高、糖耐量異常、血壓升高。Campbell等［8］發(fā)現(xiàn)卵巢切除的雌性 Sprauge-Dawley(SD)大鼠的股四頭肌葡萄糖的攝取下降，糖原合成減少，予雌激素替代后恢復正常;雌激素還能夠抑制肝脂酶的活性，使HDL分解減少，并促進載脂蛋白apoA1的合成;同時通過上調肝內LDL受體及加速LDL清除而降低LDL，對血糖、血脂等有明顯的調節(jié)作用。本研究結果顯示，生理濃度的雌激素對高糖誘導的HepG2細胞ACAT2 mRNA和蛋白表達均有下調作用，提示雌激素對HepG2細胞中ACAT2活性的影響可通過轉錄和轉錄后調節(jié)作用實現(xiàn)。

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