等位基因特異性PCR技術(shù)在5-脂氧合酶基因多態(tài)性檢測中的應(yīng)用

白春英，史鐵偉，瑞 云，于曉明，張朝軍，仝麗娟，李秀君，高麗楓，周 靜

(1赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000;2赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

5-脂氧合酶(5-LO)是花生四烯酸代謝途徑中非常關(guān)鍵的一個酶，研究發(fā)現(xiàn)該酶基因的多態(tài)性與哮喘病有關(guān)［1］。花生四烯酸的代謝產(chǎn)物白三烯(LTs)生物活性強(qiáng)烈、作用時間持久，可引起支氣管痙攣、氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性。5-LO基因含有14個外顯子，mRNA全長為2 560 bp，基因庫中記載的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)數(shù)多達(dá)36個。2012年，我們針對這36個SNPs在各個外顯子中的分布特點(diǎn)，分別采用等位基因特異性 PCR(ASPCR)法對36例健康者的5-LO基因六個位點(diǎn)的SNPs進(jìn)行了檢測，現(xiàn)分析結(jié)果。

1 步驟

1.1 引物設(shè)計(jì)及基因組DNA提取 利用Taq酶缺乏3'-5'外切酶活性的特點(diǎn)(在突變型引物擴(kuò)增正常DNA模板時，延伸反應(yīng)會因磷酸酯鍵難于形成而不能進(jìn)行，即得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變;反之表明有突變產(chǎn)生)，將突變型引物和非突變型引物分別用于同一DNA模板擴(kuò)增，判斷有無特定位點(diǎn)基因的特定突變［2］。根據(jù)這一原理針對野生型和突變型設(shè)計(jì)3'端的堿基，一般倒數(shù)第二位的堿基設(shè)計(jì)故意錯配的堿基，用以提高引物的特異性［3］。本研究設(shè)計(jì)的引物見表1。收集36例健康者的外周血標(biāo)本2 mL，提取基因組DNA作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，具體方法見參考文獻(xiàn)［4］。

1.2 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 每個SNP位點(diǎn)用AS-PCR擴(kuò)增檢測時反應(yīng)體系分為A管和B管，分別加入野生型和突變型引物，兩管中均加入對照用一對引物和共用的右側(cè)引物。本研究設(shè)計(jì)的對照用引物為EXON8的引物，左側(cè)引物為5LOEX8S:5'aga ggc gaa gtt ctc caa ca;右側(cè)引物為5LOEX8A:5'aac agg gac gga gag tga tg，PCR產(chǎn)物為600 bp，各反應(yīng)體系見表2。例如，體系1和2是用于檢測Ile293Val和Ala308Ser的，對于293位點(diǎn)來說，體系1就是A管，體系2就是B管;而對于308位點(diǎn)來說，體系2是A管，體系1是B管。同理，體系3和4是用于檢測Ala447Ser和Pro504Leu的;體系5和6是用于檢測Val542Leu和Ala549Val的。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5 min;95℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min循環(huán)35次，末次循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 本研究設(shè)計(jì)的引物

1.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 PCR擴(kuò)增后取PCR產(chǎn)物10 μL，采用2%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定 PCR擴(kuò)增結(jié)果(取5 μL DNA markerI作為標(biāo)記)。

表2 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)條帶分別為 600、500、400、300、200、100 bp，見圖1。

圖1 5-LO等位基因特異性PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

5-LO是花生四烯酸代謝途徑非常關(guān)鍵的一個酶，白三烯是引起哮喘的主要炎性介質(zhì)。5-LO抑制劑為治療哮喘的新藥，其作用機(jī)制為通過抑制5-LO的作用阻止下游產(chǎn)物白三烯的大量生成;檢測哮喘患者的5-LO基因多態(tài)性，觀察多態(tài)性對5-LO抑制劑的藥物反應(yīng)，對臨床治療哮喘有非常重要的意義。本研究采用的AS-PCR法可快速檢測5-LO的SNP，并可快速直接進(jìn)行分型，不需要測序和酶切，具有經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、易行等特點(diǎn)，特別適用于臨床大批樣本基因單個位點(diǎn)的研究。等位基因特異性PCR技術(shù)的關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)，本研究采用自行設(shè)計(jì)的引物和檢測條件，快速檢測到了5-LO六個位點(diǎn)的SNPs，可為臨床研究5-LO基因提供參考，并為哮喘的基因治療提供依據(jù)。

［1］Chunying B，Eiko M，Hidenori O，et al.A novel polymorphism，E254K，in the 5-lipoxygenase gene associated with bronchial asthma［J］.Intern J Molec Med，2008，21:139-144.

［2］李春曉，張曉龍，曹曉梅，等.特異性等位基因PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測家蠅擊倒抗性相關(guān)鈉通道的基因突變［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2007，18(3):255-256.

［3］徐克前.分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:154-158.

［4］白春英，周靜，瑞云，等.經(jīng)濟(jì)、有效提取全血基因組DNA的方法［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7(17):1795-1798.