弓形蟲MIC3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在BHK細(xì)胞中的表達(dá)

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550040)

弓形蟲是一種機(jī)會(huì)性致病、專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，能廣泛寄生于人體所有有核細(xì)胞中，人群普遍易感。孕婦感染弓形蟲易造成胎兒先天性感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸形或智力障礙［1］。弓形蟲病也是引發(fā)AIDS、腫瘤、器官移植患者等免疫功能缺陷或低下患者死亡的重要原因［2］。弓形蟲病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，診斷困難，目前其診斷主要依靠免疫學(xué)檢測的方法，但目前國內(nèi)研制的弓形蟲丙診斷試劑盒良莠不齊，重復(fù)性差［3］，加大了確診難度。弓形蟲微線粒體蛋白(MIC3)在蟲體入侵宿主細(xì)胞早期階段發(fā)揮重要作用，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異抗體［4～6］。2011～2012年，我們構(gòu)建MIC3基因真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染幼地鼠腎細(xì)胞(BHK)，以期獲取特異性MIC3表達(dá)蛋白，為研究其免疫反應(yīng)源性及弓形蟲病診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 弓形蟲RH標(biāo)準(zhǔn)株(RH株)，DH5α菌株由貴州省慢性病防治研究所保存保存，PCDNA 3.0真核表達(dá)載體由中山醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng);BHK細(xì)胞由貴州省疾控中心病毒科提供，HifectinⅡ真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑來至購于普利萊基因技術(shù)有限公司。1.5 kg雄性新西蘭兔由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供?；蚪MDNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提及DNA膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶SaⅡ、HindⅢ、T4DNA連接酶及dNTP等均為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 MIC3真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI網(wǎng)絡(luò)發(fā)布的TOX-RH-SSI MIC3基因序列利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對引物，并于引物的5端分別引入限制性內(nèi)切酶SaⅡ、HindⅢ識別位點(diǎn)保護(hù)性堿基。引物序列:P1:5/-GCGTCGACAAAATGGCGCTGTTGCACGCGC-3/(下劃線表示SaⅡ酶切位點(diǎn)序列)/;P2:5/-CCCAAGCTTTCACTGCTTAATTTTCTCACAGC-3/(下劃線表示HindⅢ酶切位點(diǎn))，由上海生工公司合成。

1.2.2 RH株MIC3擴(kuò)增、回收 取接種RH株弓形蟲3 d的小鼠腹腔液，PBS沖洗腹腔2次，3 000 r/min離心10 min，棄其上清;按基因組DNA抽提試劑盒說明書步驟提取RH株弓形蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 μL，引物P1、P2各2.5 μL(5 pmol/μL);模板 DNA 5 μL;雙蒸水 8.5 μL;Taq 聚合酶0.4 μL(5 unit/μL);反應(yīng)參數(shù):第 1～2 循環(huán)95 ℃、45 s，59 ℃、60 s，72 ℃、90 s，第 3 ～33 循環(huán) 94℃、30 s，59℃、40 s，72 ℃、60 s;最后循環(huán)72℃、5 min，4℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳觀察;按照柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 MIC3真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定 將回收并純化的MIC3和真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.0分別用適量的限制性內(nèi)切酶SaⅡ、HindⅢ消化，并用氯仿提純，將純化后MIC3片段和真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA按4∶1的比例混合，并在 T4DNA連接酶的作用下連接到PCDNA3.0質(zhì)粒載體上，構(gòu)建PCDNA-MIC3并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，鋪于SOB(含 IPTG、X-Gal、氨卞青霉素)平板上，37℃ 過夜培養(yǎng)。挑取SOB平板上白斑菌落，用含抗生素的LB培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)過夜，UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行單雙酶切和PCR鑒定。

1.2.4 弓形蟲速殖子裂解液抗原制備兔高免血清蟲體分離純化，超聲粉碎，離心取上清，測定蛋白含量，按常規(guī)方法免疫新西蘭兔，于第2次加強(qiáng)免疫后1周采用ELISA法測定抗體效價(jià)。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天接種(0.5～2)×105個(gè)BHK細(xì)胞于24孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)板表面生長85% ～95%時(shí)，用25 μL無血清、無抗生素培養(yǎng)基分別稀釋1 μg重組表達(dá)質(zhì)粒PCDNAMIC3及2～8 μL HifectinⅡ;混和稀釋后的 PCDNA3-MIC3和HifectinⅡ溶液輕輕混勻，室溫孵育15 min;用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1～2次并加入無血清無抗生素培養(yǎng)基，隨后加入前述稀釋混合物于培養(yǎng)板內(nèi)，混合使之與細(xì)胞充分接觸，于37℃孵育細(xì)胞4 h后吸凈孔內(nèi)液體，加入含血清的正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以上。分別于培養(yǎng)24、48、96 h后用0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，加DEPC處理的 PBS反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫落，離心收集脫落細(xì)胞，－80℃凍存?zhèn)溆?。以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒PCDNA3作為陰性對照。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析 用PBS離心洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于沉淀中加入含PMSO的裂解液200 μL，重懸細(xì)胞，冰浴 20 min，12 000 r/min 離心 5 min，吸取上清進(jìn)行電泳，SDS-PAGE濃縮膠5%，分離膠15%;電壓:濃縮膠為80 V，分離膠為160 V，電泳2 h。電泳結(jié)束后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色固定。

1.2.7 PCDNA-MIC3表達(dá)檢測 用等體積的PBS稀釋轉(zhuǎn)染細(xì)胞(觀察組)，反復(fù)凍融2次，超聲波處理，4℃下10 000 r/min離心10 min，取上清。另取空載PCDNA3懸液為對照組，然后分別用轉(zhuǎn)染細(xì)胞、培養(yǎng)液上清和正常BHK細(xì)胞包被酶標(biāo)板，將兔抗弓形蟲高免血清按1∶1 000稀釋，山羊抗兔Ig GHRP按1∶5 000稀釋進(jìn)行ELISA，DAB顯色，檢測兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞、培養(yǎng)液上清和正常BHK細(xì)胞PCDNA-MIC3表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 RH株弓形蟲MIC3基因體外擴(kuò)增 以RH株弓形蟲基因組DNA為模板進(jìn)行MIC3基因體外擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳，在947～1 375 bp之間有一清晰明亮的條帶，與預(yù)期的弓形蟲微線粒體蛋白MIC3片段1 120 bp大小一致(見圖1)。

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定 經(jīng)對空載質(zhì)粒PCDNA 3.0和重組PCDNA-MIC3質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切;以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，確認(rèn)已成功構(gòu)建PCDNA-NIC3重組質(zhì)粒。見圖2。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果 重組質(zhì)粒pc-MIC3能在BHK細(xì)胞內(nèi)得到較高水平表達(dá)，電泳圖譜中顯示相對分子質(zhì)量為39.8 KDa的蛋白條帶，與目標(biāo)條帶蛋白分子量一致。見圖3。

圖1 PCR結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒單雙酶切及PCR結(jié)果

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.4 PCDNA-MIC3表達(dá) 見表1。分析表1結(jié)果，PCMIC3能在BHK細(xì)胞中高效表達(dá)并具有良好的免疫源性。

表1 兩組PCMIC3蛋白表達(dá)比較

3 討論

隨著分子生物學(xué)和基因工程等科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，提高免疫診斷的特異性和敏感性，采用克隆表達(dá)的功能性蛋白作為抗原已成趨勢。近年來弓形蟲膜表面蛋白1(SAG1)、棒狀體蛋白2(ROP2)和致密顆粒蛋白7(GRA7)等相繼被表達(dá)，并用于弓形蟲病的檢測［6］。MIC3為弓形蟲微線粒體蛋白，發(fā)現(xiàn)于1991年，已有研究表明，弓形蟲在對宿主細(xì)胞的黏附和入侵過程中，伴隨微線粒體內(nèi)容物的釋放，其中MIC3是蟲體分泌的非常重要的黏附因子，且與蟲體對宿主的識別和結(jié)合密切相關(guān)，并在蟲體入侵宿主細(xì)胞早期階段發(fā)揮重要作用［4，5］。有學(xué)者對弓形蟲MIC3蛋白的二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測顯示，MIC3蛋白的性質(zhì)較穩(wěn)定，且有較多可能成為抗原表位的區(qū)域，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，是目前作為弓形蟲病診斷的優(yōu)勢抗原［7］。本研究用在真核細(xì)胞內(nèi)具高效表達(dá)的良好載體PCDNA3.0構(gòu)建弓形蟲MIC3重組質(zhì)粒，并用構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE電泳，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中可見約為39.8 Kd的明顯條帶，間接ELISA分析表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液作為抗原能被弓形蟲特異性抗體所識別，培養(yǎng)液上清未檢測出相關(guān)抗原，顯示PCDNA3-MIC3重組質(zhì)粒能在BHK細(xì)胞中高效表達(dá)，且表達(dá)蛋白能被弓形蟲特異性抗體所識別，具有良好的免疫源性，證實(shí)MIC3具有作為弓形蟲病診斷抗原的優(yōu)勢?？傊?，本研究為PCMIC3重組蛋白純化，建立弓形蟲病敏感度高、特異性強(qiáng)的血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

［1］韓美君，李雅杰，景立新，等.孕婦弓形蟲感染胎盤垂直傳播狀況調(diào)查［J］.中國公共衛(wèi)生，2006，22(1):14-15.

［2］彭祚全，揚(yáng)連第.弓形體病診斷學(xué)［M］.武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998:35-38.

［3］何艷燕，蔣守富，馬杏寶，等.國內(nèi)外16種弓形蟲診斷試劑盒的評估［J］.旅行醫(yī)學(xué)科學(xué)，2008，14(3):43-45.

［4］Dubremetz JF，Achbrou A，Bermudes D，et al.Kinetics and pattern of organelle exocytosis during toxoplasma gondii hostcell interaction［J］.Parasitol Res，1993，79(5):402-408.

［5］Soldati D，Dubremetz JF.Microneme proteins:structural and functional requirements to promote adhesion and invasion by the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii［J］.Int J Parasitol，2001，31(12):1293-1302.

［6］黃澤智，趙晉英，李艷偉，等，重組抗原在弓形蟲病診斷中的應(yīng)用［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2011，6(10):779-782.

［7］江濤，馬立安，趙俊龍，等.弓形蟲MIC3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測［J］.長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2007，4(1):1-4.