三七總皂苷對(duì)百草枯中毒鼠肺組織NF-κB與血清IL-1β表達(dá)的影響

(昆明市延安醫(yī)院，昆明 650051)

百草枯(PQ)是目前廣泛使用的有機(jī)雜環(huán)類接觸性除草劑，人類中毒后可引起多臟器功能損害，其中以急性肺損傷(ALI)表現(xiàn)最為突出［1］，病死率高，至今仍無特效解毒劑。2010年6月，我們觀察了三七總皂甙(PNS)對(duì)PQ急性中毒大鼠肺損傷的治療作用并探討其作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)SD雄性大鼠150只，體質(zhì)量200～250 g，昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PQ溶液(山東三元工貿(mào)有限公司)，試驗(yàn)前稀釋為1%。PNS注射液(昆明制藥廠)。IL-1β、NF-κB 試劑盒(大連寶生物)，Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基)。

1.2 模型制作及干預(yù) 將150只大鼠隨機(jī)分為三組:PQ組(60只)及PNS組(60只)均予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PQ 25 mg/kg一次性灌胃染毒制作PQ中毒肺損傷模型，對(duì)照組(30只)予等量生理鹽水灌胃。制模前15 min PNS組陰莖靜脈注射PNS 50 mg/kg;PQ組和對(duì)照組分別予等體積生理鹽水陰莖靜脈注射。

1.3 觀察項(xiàng)目 ①肺組織損傷:分別在制模后6、12 h及1 d、3 d、5 d及7 d取血后處死大鼠，肺組織取材后常規(guī)石蠟切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。②血漿IL-1β水平:分別于制模后第6、12 h及1 d、3 d、5 d及7 d處理大鼠，取靜脈血離心，將血清置－70℃冰箱保存，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。③肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞(PMN)NF-κB p65表達(dá)檢測(cè):大鼠處死后分別予上述時(shí)間點(diǎn)收集支氣管肺泡灌洗液離心留取上清，沉淀重新懸浮后，進(jìn)行密度梯度離心，PMN富集層進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，PMN純度＞88%方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。一抗采用兔抗NF-κB P65多抗，相應(yīng)生物素標(biāo)記的第二抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。體積較小且核分葉的細(xì)胞為PMN。操作過程按試劑盒說明書進(jìn)行。鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞(胞膜、胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色著色顆粒)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。④PMN凋亡率:BALF中提純的PMN懸液經(jīng)PI染料避光染色10 min后，上流式細(xì)胞儀，染色陽(yáng)性為凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織損傷程度 對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞滲出。PQ組肺間隔增厚，肺泡壁斷裂，大量PMN等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肺組織損傷程度加重。PNS組肺組織有同PQ組相似的病理表現(xiàn)，但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肺組織損傷程度較輕。

2.2 相關(guān)指標(biāo)比較 詳見表1。

表1 各組鼠血清白介素-1β、NF-κB陽(yáng)性率及 PMN 凋亡率(n=10， ±s)

表1 各組鼠血清白介素-1β、NF-κB陽(yáng)性率及 PMN 凋亡率(n=10， ±s)

注:與對(duì)照組比較，#P＜0.00，與PQ組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05

組別 IL-1β(μg/mL)NF-κB 陽(yáng)性率(%)PMN 凋亡率(%)PNS 組6 h 8.56 ±1.28#△ 13.14 ±3.10#△ 25.34 ±4.42#△12 h 10.56 ±2.44#△ 15.47 ±3.48#△ 23.51 ±2.82#△1 d 12.64 ±2.82#△ 19.55 ±4.54#△ 20.78 ±1.69#△3 d 13.72 ±3.27#△ 24.62 ±6.45#△ 18.44 ±2.59#△5 d 9.48 ±2.10#△ 12.83 ±2.72#△ 21.50 ±3.63#△7 d 7.36 ±1.45 8.36 ±2.45 27.87 ±3.47 PQ組6 h 9.92 ±2.12# 16.92 ±4.53# 23.45 ±4.36#12 h 11.86 ±2.64# 20.72 ±5.24# 20.64 ±3.58#1 d 13.57 ±2.95# 26.55 ±5.78# 18.05 ±2.32#3 d 15.93 ±3.23# 30.43 ±7.15# 16.58 ±1.57#5 d 12.46 ±2.58# 15.46 ±3.67# 19.84 ±3.41#7 d 8.86 ±1.24 11.84 ±2.87 24.15 ±3.32對(duì)照組6 h 6.25 ±1.43 8.15 ±2.45 29.34 ±4.33 1 d 6.51 ±1.30 7.98 ±1.56 30.50 ±6.62 3 d 6.84 ±1.52 8.50 ±2.33 28.68 ±3.25

3 討論

PQ進(jìn)入機(jī)體后，造成機(jī)體一系列應(yīng)激反應(yīng)，激活中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞，刺激神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)釋放大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等多種生物學(xué)效應(yīng)因子。研究證實(shí)，上述炎癥介質(zhì)在PQ中毒急性肺損傷及肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［2］。

PMN是由骨髓系造血干細(xì)胞分化而來的，產(chǎn)生速度快，存活期短(24～48 h)，一旦分化成熟即啟動(dòng)其自發(fā)性凋亡［3］。研究表明，細(xì)胞凋亡是炎癥過程中調(diào)控PMN數(shù)量和反應(yīng)性的有效措施，能夠保證炎癥反應(yīng)的適度水平，避免炎癥反應(yīng)擴(kuò)大化，減少自身組織細(xì)胞損傷［4］。PMN在肺組織中大量聚集和持續(xù)激活，導(dǎo)致其發(fā)生呼吸爆發(fā)和脫顆粒，釋放蛋白酶和各種炎性介質(zhì)等導(dǎo)致肺損傷。

IL-1β是介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)的一種多肽，在大多數(shù)炎癥和免疫反應(yīng)中是關(guān)鍵性的始動(dòng)信號(hào)［5，6］，在肺纖維化發(fā)病過程中，IL-1β可調(diào)節(jié)輔助T淋巴細(xì)胞的活性，趨化粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的積聚，介導(dǎo)肺泡炎癥期的損傷;還能刺激肺成纖維細(xì)胞增殖，對(duì)膠原合成有一定促進(jìn)作用。有研究表明，急性呼吸窘迫綜合征死亡患者血清的IL-1β水平較生存者明顯升高，用其血清孵育正常人外周血淋巴細(xì)胞可促使淋巴NF-κB p65蛋白成分明顯增加，IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯升高［7］。NF-κB作為調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的樞紐型環(huán)節(jié)，其活化可引起該網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控失衡［8］:一方面能啟動(dòng)眾多炎性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而形成“炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)”啟動(dòng)肺部炎癥，并通過正反饋的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)促進(jìn)肺部炎癥的發(fā)展;另一方面，許多致肺纖維化因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域也含有NF-κB的固定的核苷酸κB序列，NF-κB活化后和含有κB序列的DNA結(jié)合，啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。Walley等［9］發(fā)現(xiàn)，小鼠氣管內(nèi)注射脂多糖后，支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞NB-κB的活性增強(qiáng)，伴有早期依賴NB-κB的細(xì)胞因子IL-1β和TNF-a表達(dá)增高。佟飛等［10］應(yīng)用電泳遷移率改變分析法(EMSA)觀察到，NF-κB在PQ染毒大鼠肺組織中的表達(dá)增加，表明NF-κB可能參與了PQ中毒肺損傷的發(fā)生。

本研究PQ組IL-1 β和NF-κB p65水平明顯增加，PMN凋亡率降低，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肺組織損傷程度加重，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。提示NF-κB p65和IL-1β可能參與了PQ中毒急性肺損傷，并可能進(jìn)而影響后期肺纖維化的形成。PNS組 NF-κB p65和 IL-1β表達(dá)降低，PMN凋亡率提高，且肺損傷化程度減輕。其可能機(jī)制:①PNS能抑制PMN內(nèi)NF-κB的活化，減少細(xì)胞間黏附分子表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)作用［11］;②PNS可提高小鼠的血清溶血素水平，促進(jìn)其單核-巨噬細(xì)胞碳廓清作用，增強(qiáng)小鼠的單核-腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，提高小鼠NK細(xì)胞活性［12］。但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果也顯示，NF-κB p65與IL-1β關(guān)系密切，兩者表達(dá)具有時(shí)間上的一致性，但兩者何為始動(dòng)因素仍待進(jìn)一步研究。

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