慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)及樹(shù)突棘密度的變化*

賈 賀，張博愛(ài)，劉 宇，張小敏，姬亞杰，李 星，劉榮麗

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)重要組成部分，與學(xué)習(xí)和記憶有著密切的關(guān)系，尤其CA1區(qū)細(xì)胞承載著信息的加工、強(qiáng)化和傳遞功能。海馬血管構(gòu)筑的獨(dú)特性，使海馬成為腦內(nèi)對(duì)缺血最敏感的區(qū)域［1］。腦缺血可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的一系列損傷性改變，在行為學(xué)上表現(xiàn)為長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙。樹(shù)突是神經(jīng)元信息傳遞的入口，樹(shù)突棘是興奮性突觸傳遞的原始位點(diǎn)［2］，因此海馬錐體細(xì)胞樹(shù)突的形態(tài)及樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)和功能的可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎(two－vessel occlusion，2VO)，經(jīng)快速灌注Golgi染色，研究慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突的分支、長(zhǎng)度及樹(shù)突棘密度，以期為慢性腦缺血疾病的臨床研究和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物和主要儀器

健康SD雌性大鼠，6月齡，體重320～350 g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，每組45只，每組選取2周、4周8周3個(gè)時(shí)點(diǎn)，每個(gè)時(shí)點(diǎn)15只大鼠。KD－400型振動(dòng)切片機(jī)。Morris水迷宮儀。

2 方法

2.1 慢性腦缺血模型建立 參照Ni等［3］的方法制備腦缺血大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，保證手術(shù)期間有自主呼吸。仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開(kāi)，小心分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和近心端，以確保阻斷頸總動(dòng)脈血流，縫合皮膚。術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃，手術(shù)后動(dòng)物送至有通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的動(dòng)物房飼養(yǎng)。

假手術(shù)組動(dòng)物除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，余過(guò)程與模型組相同。

2.2 行為學(xué)評(píng)價(jià)及造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 從術(shù)后2周、4周、8周開(kāi)始，分別將各組動(dòng)物于Morris水迷宮中連續(xù)定位航行訓(xùn)練4 d，每天訓(xùn)練3次，每次采取不同的入水點(diǎn)訓(xùn)練120 s。若動(dòng)物在120 s之內(nèi)找到平臺(tái)，使其在上停留15 s;若120 s之內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其誘導(dǎo)到平臺(tái)上并停留15 s，方結(jié)束1次訓(xùn)練。如此訓(xùn)練4 d，分別記錄每只動(dòng)物的潛伏期，潛伏期越短，路程越近，說(shuō)明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越好［4］。

取第4 d假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，同時(shí)計(jì)算造模大鼠第4 d的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比值，該值＞20%定為認(rèn)知功能障礙大鼠，即為造模成功的大鼠［5］。

2.3 取材及制片 對(duì)兩組大鼠分別于2周、4周、8周進(jìn)行快速灌注Golgi染色［6］(模型組選用造模成功的大鼠)。0.5%亞硝酸鈉液快速灌注至流出液體無(wú)血色，10%甲醛溶液灌注固定，使之充分將前液置換，靜置1～2 h。再用媒染液(5%水合氯醛，5%重鉻酸鉀，10%甲醛混合液)慢速灌注，至流出濃厚橘紅色液，略侯1～2 h。開(kāi)顱取出大腦半球，從前中1/3處向后取組織塊約8 mm，浸泡于媒染液中，置暗處避光于37℃溫箱內(nèi)24 h。然后用1%硝酸銀溶液浸泡鍍銀，置暗處37℃溫箱內(nèi)3 d，每天換新銀液。用振動(dòng)切片機(jī)經(jīng)海馬區(qū)冠狀位連續(xù)切片(切片厚100 μm)。切片分別經(jīng)2%重鉻酸鉀溶液、蒸餾水漂洗，依次脫水、透明、封片，光鏡下觀(guān)察。

2.4 圖像處理及分析 采集圖像，所有圖像均采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。在每只大鼠的切片中，選擇海馬CA1區(qū)背景清晰且被染出錐體神經(jīng)元密度均勻的5張切片，每張切片測(cè)量4個(gè)形態(tài)完整的細(xì)胞，每組不同時(shí)點(diǎn)共選取80個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察。

2.5 樹(shù)突分支、長(zhǎng)度及樹(shù)突棘的密度測(cè)定

2.5.1 樹(shù)突的分支及長(zhǎng)度 采用Sholl插件對(duì)樹(shù)突的分支及長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，200倍顯微鏡下以神經(jīng)元胞體為圓心，做間距為10 μm的同心圓，統(tǒng)計(jì)樹(shù)突與同心圓的交點(diǎn)數(shù)之和，用交點(diǎn)總數(shù)反映樹(shù)突的分支和長(zhǎng)度，見(jiàn)圖1。

2.5.2 樹(shù)突棘的密度 在1000倍油鏡下觀(guān)察樹(shù)突棘，從胞體發(fā)出的樹(shù)突第1次分支開(kāi)始，計(jì)算30～60 μm長(zhǎng)度范圍內(nèi)樹(shù)突棘的個(gè)數(shù)，以每10 μm樹(shù)突棘個(gè)數(shù)反映其密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩比較，組間均數(shù)的兩兩比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的行為學(xué)改變

模型組大鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)，與假手術(shù)組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明模型組大鼠記憶功能受損，出現(xiàn)一定的認(rèn)知功能障礙。并隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，認(rèn)知功能障礙顯著加重，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠潛伏期比較Table 1.The latency of rats in each group(.n=15)

表1 各組大鼠潛伏期比較Table 1.The latency of rats in each group(.n=15)

#P＜0.05 vs sham－operated;▲P＜0.05 vs 2 weeks;*P＜0.05 vs 4 weeks.

Group 2 weeks 4 weeks 8 weeks Sham －operated 38.31±30.36 38.43±20.32 37.38±22.71 Model 69.39±24.68# 74.65±29.54#▲ 98.48±20.95#*

2 樹(shù)突分支及長(zhǎng)度的變化

2周模型組樹(shù)突的交點(diǎn)總數(shù)與相應(yīng)假手術(shù)組相比無(wú)明顯變化，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);4周、8周模型組樹(shù)突交點(diǎn)總數(shù)與相應(yīng)假手術(shù)組相比均顯著減少(P＜0.01)。

模型組樹(shù)突的交點(diǎn)總數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，4周組樹(shù)突交點(diǎn)總數(shù)較2周組顯著減少(P＜0.05)，8周組樹(shù)突交點(diǎn)總數(shù)較4 周組顯著減少(P ＜0.01)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 3.Total number of intersection points of dendrites in hippocampal CA1 pyramidal cells in each group..n=80.＊＊P ＜0.01 vs sham;▲▲P ＜0.01 vs 2 weeks;△△P ＜0.01 vs 4 weeks.圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突交點(diǎn)總數(shù)

3 樹(shù)突棘密度的變化

模型組樹(shù)突棘密度與相應(yīng)假手術(shù)組相比均顯著減少(P＜0.01);模型組樹(shù)突棘密度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，4周組樹(shù)突棘密度較2周組顯著減少(P＜0.05)，8周組樹(shù)突棘密度較4周組顯著減少(P＜0.01)，見(jiàn)圖4、5。

Figure 4.Spine density in hippocampal CA1 pyramidal cells in each group(Golgi staining，×1000).A:2－week sham－operated group;B:2－week model group;C:4－week model group;D:8－week model group.圖4 海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突棘

Figure 5.Spine density in hippocampal CA1 pyramidal cells in each group..n=80.＊＊P＜0.01 vs sham;▲▲P＜0.01 vs 2 weeks;△△P ＜0.01 vs 4 weeks.圖5 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突棘密度

討 論

樹(shù)突是神經(jīng)元信息接收的重要區(qū)域，具有接收和整合突觸傳遞的功能。樹(shù)突表面有許多棘狀突起，稱(chēng)樹(shù)突棘，是形成突觸的具體位點(diǎn)，樹(shù)突的分支、伸展長(zhǎng)度及樹(shù)突棘均可擴(kuò)大神經(jīng)元接受刺激的表面積，在神經(jīng)元信息傳遞和加工中起著至關(guān)重要的作用［7］。慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見(jiàn)的病理狀態(tài)，慢性腦缺血后能量代謝障礙，不能滿(mǎn)足組織需要，可導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。Tsuchiya等［8］研究大鼠2VO術(shù)后腦血流變化，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周海馬血流量下降20%，皮質(zhì)血流量下降30%～45%，與此同時(shí)，海馬葡萄糖利用率亦明顯下降15%，皮質(zhì)葡萄糖利用率下降20% ～30%。術(shù)后8周到3個(gè)月海馬血流量下降約60%，腦低血流逐漸轉(zhuǎn)為慢性狀態(tài)［9］，并伴隨一系列神經(jīng)遞質(zhì)改變、腦白質(zhì)損害、神經(jīng)元缺失等病理改變［10］。Bennett等［11］通過(guò)研究慢性腦缺血神經(jīng)損傷機(jī)制，發(fā)現(xiàn)2VO術(shù)后大鼠海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞逐漸凋亡，且其凋亡數(shù)量與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。由此可見(jiàn)，海馬是腦內(nèi)缺血的敏感易損區(qū)，慢性腦缺血可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的固縮、凋亡以及樹(shù)突損傷，從而構(gòu)成了進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

大鼠2VO術(shù)后腦低血流改變與人類(lèi)老齡化慢性腦缺血很相似，已被廣泛用來(lái)研究慢性腦缺血對(duì)認(rèn)知功能障礙的影響。水迷宮已被證實(shí)是評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的有效工具之一［4］。因此，本研究通過(guò)建立2VO模型，分別于腦缺血不同時(shí)點(diǎn)應(yīng)用水迷宮測(cè)量逃避潛伏期來(lái)判斷大鼠慢性腦缺血后認(rèn)知功能障礙程度，發(fā)現(xiàn)隨著缺血程度加重，大鼠認(rèn)知功能障礙顯著加重。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)慢性腦缺血海馬錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)及樹(shù)突棘密度的研究發(fā)現(xiàn)2周模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突分支及長(zhǎng)度減少較輕有關(guān)，可能與損傷時(shí)間較短，一部分血液代償使樹(shù)突損傷并不明顯。NO是一種血管舒張劑，研究發(fā)現(xiàn)2VO術(shù)后海馬區(qū)NO濃度可升高2周［9］，Mracsko等［12］發(fā)現(xiàn)在2VO模型早期，海馬和額葉皮層COX－2(cyclooxygenase－2)和eNOS(endothelial nitric oxide synthase)酶系水平增高，提示缺血引起血管興奮性反應(yīng)。這些反應(yīng)均可促使各種因子參與改善早期腦缺血及血管重建，起到一定代償作用。但隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，缺血缺氧程度加重，失代償后導(dǎo)致樹(shù)突分支及長(zhǎng)度明顯減少。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M樹(shù)突棘密度較假手術(shù)組均有顯著減少，表明慢性腦缺血對(duì)海馬CA1區(qū)的損傷確切。2VO術(shù)后腦血流量開(kāi)始逐漸下降，引起腦內(nèi)糖代謝及ATP酶活性顯著下降，長(zhǎng)期腦供血供氧不足，腦內(nèi)能量衰竭導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突不可逆損傷，從而引起形態(tài)學(xué)改變及樹(shù)突棘脫落。微管相關(guān)蛋白(microtubule－associated protein 2，MAP－2)和網(wǎng)格蛋白參與細(xì)胞骨架的形成，與樹(shù)突微管形成密切相關(guān)，可反映樹(shù)突的分支、重塑，被認(rèn)為是對(duì)腦缺血高度敏感的標(biāo)記物。Kudo等［13］亦報(bào)道2VO術(shù)后6～8周MAP－2和網(wǎng)格蛋白表達(dá)均顯著下降。故可推斷慢性腦缺血后MAP－2和網(wǎng)格蛋白表達(dá)減少引起海馬錐體細(xì)胞樹(shù)突骨架蛋白及微管裝配異常，從而導(dǎo)致其分支及長(zhǎng)度的減少及樹(shù)突棘的改變。樹(shù)突棘是突觸的具體位點(diǎn)。慢性缺血缺氧時(shí)NO等神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放，神經(jīng)電活動(dòng)受到抑制［9，14］，均可造成樹(shù)突棘大量脫落及結(jié)構(gòu)學(xué)的病理改變，改變突觸的功能，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知的缺陷。

［1］姬西團(tuán)，章 翔，費(fèi) 舟，等.人與大鼠海馬血管構(gòu)筑的比較性研究［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2004，20(2):179 －182.

［2］Tada T，Sheng M.Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis［J］.Curr Opin Neurobiol，2006，16(1):95－101.

［3］Ni JW，Matsumoto K，Li HB，et al.Neuronal damage and decrease of central acetylcholine level following permanent occlusion bilateral common carotid arteries in rats［J］.Brain Res，1995，673(2):290 －296.

［4］D’Hooge R，De Deyn PP.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory［J］.Brain Res Brain Res Rev，2001，36(1):60 －90.

［5］Yu J，Liu C，Zhang X，et al.Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi－infarct dementia in rats［J］.Physiol Behav，2005，86(4):434 －441.

［6］杜卓民，衛(wèi)光輝，王 宜，等.實(shí)用組織學(xué)技術(shù)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998.143 －144.

［7］Nimchinsky EA，Sabatini BL，Svoboda K.Structure and function of dendritic spines［J］.Annu Rev Phisiol，2002，64:313－353.

［8］Tsuchiya M，Sako K，Yura S，et al.Cerebral blood flow and histopathological changes following permanent bilateral carotid artery ligaion in Wistar rats［J］.Exp Brain Res，1992，89(1):87 －92.

［9］舒 怡，張 洪，章軍建.慢性腦低灌注的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.中華腦血管病雜志，2010，4(3):199 －206.

［10］劉漢興，章軍建.慢性腦缺血與認(rèn)知功能障礙［J］.國(guó)際醫(yī)學(xué):腦血管疾病分冊(cè)，2004，12(4):278 －281.

［11］Bennett SA，Teimiswood M，Chen JH，et al.Chronic cerebral hypoperfusion elicits neuronal apoptosis and behavioral impairment［J］.Neuroreport，1998，9(1):161 － 166.

［12］Mracsko E，Hugyecz M，Institoris A，et al.Changes in pro－oxidant and antioxidant enzyme levels during cerebral hypoperfusion in rats［J］.Brain Res，2010，1321(1):13 －19.

［13］Kudo T，Tada K，Takeda M，et al.Learning impairment and microtubule－associated protein 2 decrease in gerbils under chronic cerebral hypoperfusion［J］.Stroke，1990，2l(8):1205－1209.

［14］Aytac E，Seymen HO，Uzun H，et al.Effect of iloprost on visual evoked potentials and brain tissue oxidative stress after bilateral common carotid artery occlusion［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2006，74(6):373 －378.