一種IFN-γELISPOT檢測(cè)方法的建立

劉培培 王洪芳 呂 品 王少雄 (上海澤潤(rùn)生物科技有限公司分析制劑室，上海201203)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)，并逐漸發(fā)展和完善起來(lái)的一種能夠從單細(xì)胞水平檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和特異性細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的免疫技術(shù)，具有較高的穩(wěn)定性、敏感性和特異性。目前，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗和藥品的檢測(cè)、自身免疫疾病的檢測(cè)、病毒以及腫瘤研究、結(jié)核病高危人群的篩查以及各種免疫性疾病的研究和檢測(cè)［1，2］;干細(xì)胞功能分析;B細(xì)胞雜交瘤檢測(cè)，藥物免疫學(xué)反應(yīng)和抗原表位肽的篩選等。國(guó)家藥審中心要求:“在評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫效價(jià)時(shí)，應(yīng)當(dāng)建立檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫的方法(如特異性CTL反應(yīng)的方法或ELISPOT方法等”。IFN-γ是由Th1細(xì)胞亞群分泌的一類細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的活化和增殖介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)。因此建立IFN-γELISPOT檢測(cè)方法，可以作為檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫的有效方法。雖然ELISPOT技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于機(jī)體免疫功能的測(cè)定，但是該技術(shù)尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化，其陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)各不相同，因此在ELISPOT方法建立與應(yīng)用過(guò)程中，這方面仍需要進(jìn)一步的探討。

本文以本公司自制的融合蛋白疫苗，免疫C57BL/6小鼠，從免疫途徑、免疫劑量、細(xì)胞濃度以及肽刺激濃度等方面確立了檢測(cè)該融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的特異性IFN-γ的ELISPOT方法，為該疫苗的細(xì)胞免疫研究提供了一種準(zhǔn)確、靈敏、特異的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6小鼠，6～8周齡，雌性，SPF級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(滬)2008-0058;無(wú)熱原的融合蛋白疫苗、樣品稀釋液(無(wú)熱原的空白佐劑溶液)由本公司制備;淋巴細(xì)胞分離液、無(wú)血清培養(yǎng)基為達(dá)科為公司產(chǎn)品;RPMI1640、FBS為Gibco公司產(chǎn)品;刀豆蛋白(ConA)為Sigma公司產(chǎn)品;Mouse-IFN-γ ELISPOT kit、AEC kit為 BD 公司產(chǎn)品;刺激肽為上海生工合成產(chǎn)品，純度＞95%。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組腹部皮下注射疫苗，注射量為0.5 ml/只，免疫濃度為 30 μg/ml，對(duì)照組每只注射0.5 ml的樣品稀釋液，14天后，加強(qiáng)免疫一次。

1.2.2 脾淋巴細(xì)胞分離 C57BL/6小鼠加強(qiáng)免疫14天后，摘眼球取血并處死，無(wú)菌取脾，置于3 ml淋巴細(xì)胞分離液中，在200目的篩網(wǎng)中研磨成單個(gè)細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至15 ml的離心管中，在細(xì)胞懸液上輕輕覆蓋一層1640培養(yǎng)基，2 000 r/min離心30分鐘，吸取淋巴細(xì)胞層，用無(wú)菌PBS溶液清洗2次，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 ELISPOT實(shí)驗(yàn)步驟 按照試劑盒說(shuō)明書要求，稀釋捕獲抗體，100μl/孔，4℃包被過(guò)夜。次日傾倒包被液，無(wú)菌PBS洗滌3遍，再用含10%FBS的1640培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，200μl/孔，室溫封閉2小時(shí);棄封閉液，加入脾淋巴細(xì)胞，100μl/孔，實(shí)驗(yàn)孔加入刺激肽，陰性對(duì)照孔中不加刺激物，ConA作為陽(yáng)性對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)一段時(shí)間;傾倒培養(yǎng)基，以200μl/孔冰冷的去離子水，4℃冰浴20分鐘裂解細(xì)胞;用PBST洗板4次，加入檢測(cè)抗體，100μl/孔，室溫避光孵育1小時(shí);PBST洗板4次，加入酶標(biāo)親和素，100μl/孔，室溫避光孵育1小時(shí);用PBST洗板3次、再用PBS洗板2次，加入底物顯色液，100μl/孔，室溫下避光顯色15～20分鐘;去離子水終止色反應(yīng)，CTL S5 Versa斑點(diǎn)分析儀進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

1.2.4 ELISPOT 方法的建立

1.2.4.1 免疫途徑的選擇 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，每組7只，比較3種免疫途徑，分別為皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，給藥量為0.5 ml/只，免疫濃度為30μg/ml，各免疫途徑相應(yīng)的對(duì)照組每只注射0.5 ml的樣品稀釋液。14天后，加強(qiáng)免疫一次，于第28天，頸部脫臼處死小鼠，無(wú)菌取脾，分離淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將脾淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至3×106個(gè)/ml，100 μl/孔種于 ELISPOT 板，加入刺激肽，1μg/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時(shí)后，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

1.2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的選擇 隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組小鼠、對(duì)照組小鼠各5只，無(wú)菌取脾，分離淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將脾淋巴細(xì)胞濃度分別調(diào)整至3×106個(gè)/ml，100μl/孔種于 ELISPOT板，加入刺激肽，1μg/孔，陰性對(duì)照孔不加刺激物，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)，于12、24、48和72小時(shí)，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

1.2.4.3 細(xì)胞濃度的選擇 隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組小鼠5只，無(wú)菌取脾，分離淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將脾淋巴細(xì)胞濃度分別調(diào)整至2 ×106、3 ×106、4 ×106、5 ×106、6 ×106個(gè)/ml，100 μl/孔種于 ELISPOT 板，加入刺激肽，1 μg/孔，陰性對(duì)照孔不加刺激物，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時(shí)后，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

1.2.4.4 特異性肽刺激濃度的選擇 隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠各5只，無(wú)菌取脾，分離淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將脾淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至4×106個(gè)/ml，100 μl/孔種于ELISPOT板，用培養(yǎng)基對(duì)刺激肽進(jìn)行稀釋，按照 0.125、0.25、0.5、1、2、4 和 8 μg/孔的刺激量分別加入，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時(shí)后，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

1.2.5 融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)檢測(cè)

將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，其中5組為實(shí)驗(yàn)組，另外一組為對(duì)照組。將疫苗用樣品稀釋液進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為:120、30、7.5、1.8和0.46μg/ml，分別按組給藥，每個(gè)濃度為一組，注射量為0.5 ml/只，對(duì)照組每只注射0.5 ml的樣品稀釋液。14天后，加強(qiáng)免疫一次，于第28天，頸部脫臼處理動(dòng)物，無(wú)菌取脾，分離淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將脾淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至4×106個(gè)/ml，100μl/孔種于ELISPOT 板，加入刺激肽，1 μg/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時(shí)后，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果分析 圖1中的每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞(Spot forming cell，SFC)，斑點(diǎn)數(shù)與該孔細(xì)胞總數(shù)的比值即為分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞比率，該比率的高低反映著機(jī)體的IFN-γ水平和機(jī)體細(xì)胞免疫效應(yīng)的強(qiáng)度。

陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):參考文獻(xiàn)［3-5］并結(jié)合本研究的實(shí)際情況，設(shè)定抗原刺激孔的斑點(diǎn)數(shù)大于55個(gè)斑點(diǎn)/106個(gè)細(xì)胞，且大于4倍的陰性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中陽(yáng)性小鼠的只數(shù)與每組小鼠總數(shù)的比值為免疫陽(yáng)轉(zhuǎn)率，該比率的高低反映該疫苗細(xì)胞免疫強(qiáng)度。

2.2 動(dòng)物免疫途徑的確定 由圖2結(jié)果可知，在30μg/ml免疫濃度下，皮下注射免疫效果最佳，平均斑點(diǎn)數(shù)最多，腹腔注射次之，而肌肉注射免疫效果不佳，3種免疫方式相應(yīng)的對(duì)照組，均呈陰性反應(yīng)。從3種免疫途徑的比較結(jié)果看，選擇皮下注射作為該疫苗的最佳小鼠免疫方式。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的確定 由圖3的結(jié)果可知，在刺激肽的作用下，實(shí)驗(yàn)組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而遞增，對(duì)照組小鼠非特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)在48小時(shí)前無(wú)明顯變化，維持在一定水平，但在48小時(shí)后顯著增強(qiáng)，達(dá)到40多個(gè)斑點(diǎn)。在無(wú)刺激肽作用下，實(shí)驗(yàn)組小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)一定的遞增趨勢(shì)，但幅度很小，最高可到12個(gè)/孔;對(duì)照組小鼠則無(wú)明顯變化，一直維持在5～10個(gè)/孔。由此可知，在刺激肽作用下，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間控制在24～48小時(shí)范圍內(nèi)比較合適。

2.4 細(xì)胞濃度的確定 由圖4可知，斑點(diǎn)數(shù)隨著脾淋巴細(xì)胞濃度的增加而增加，當(dāng)脾淋巴細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/孔時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞形成的特異性斑點(diǎn)數(shù)平均達(dá)到75個(gè)/孔，對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞形成的非特異性斑點(diǎn)數(shù)較少，平均斑點(diǎn)數(shù)為12個(gè)/孔，本底干擾小。當(dāng)脾淋巴細(xì)胞濃度小于3×105個(gè)/孔時(shí)，斑點(diǎn)數(shù)太少，小于20個(gè)/孔，實(shí)驗(yàn)誤差就會(huì)增大;當(dāng)細(xì)胞濃度大于4×105個(gè)/孔時(shí)，對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞形成的非特異性斑點(diǎn)數(shù)逐步升高，大于40個(gè)/孔，本底干擾大，影響結(jié)果判斷。所以最佳細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/孔。

圖1 IFN-γELISPOT斑點(diǎn)形成照片F(xiàn)ig.1 Spot forming pictures of IFN-γ ELISPOT

圖2 不同免疫途徑下小鼠細(xì)胞免疫強(qiáng)度比較Fig.2 Effects of different immunization routes

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IFN-γ分泌的影響Fig.3 Effects of culture time on the IFN-γ secretion

圖4 脾淋巴細(xì)胞濃度對(duì)IFN-γ分泌的影響Fig.4 Effects of cells concentration on the IFN-γ secretion

圖5 肽刺激濃度對(duì)IFN-γ分泌的影響Fig.5 Effects of peptide concentration on the IFN-γ secretion

表1 融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫量效關(guān)系檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The results of the fusion protein vaccine-induced cellular immune response

圖6 疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫強(qiáng)度量效關(guān)系Fig.6 Dose effect relation of the fusion protein vaccine

2.5 肽刺激濃度的確定 由圖5可知，在0.125～2μg/孔的肽刺激濃度范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠形成的特異性斑點(diǎn)數(shù)隨肽刺激濃度的增加而增加，當(dāng)肽刺激濃度為4μg/孔，斑點(diǎn)數(shù)減少;而對(duì)照組小鼠的非特異性斑點(diǎn)數(shù)隨著肽刺激濃度的增加一直維持遞增的趨勢(shì)，通過(guò)綜合比較，肽刺激濃度選擇0.5～2μg/孔的范圍比較合適，實(shí)驗(yàn)選擇1μg/孔作為最佳肽刺激量，在此濃度下，實(shí)驗(yàn)組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞形成的斑點(diǎn)數(shù)較多，而對(duì)照組小鼠形成的非特異性斑點(diǎn)較低，本底干擾較小。

2.6 融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)檢測(cè) 隨著疫苗免疫濃度的逐漸增加，特異性分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞形成的斑點(diǎn)數(shù)也逐漸增加，當(dāng)免疫劑量為30μg/ml時(shí)，平均斑點(diǎn)數(shù)最高，陽(yáng)轉(zhuǎn)率也最大，達(dá)到75%;當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí)，平均斑點(diǎn)數(shù)有所減少。由于動(dòng)物個(gè)體差異以及動(dòng)物機(jī)體對(duì)于藥物的敏感程度各有差異，所以同組間小鼠特異性分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞形成的斑點(diǎn)總數(shù)有一定的差異，組間偏差較高，結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組小鼠均呈陰性反應(yīng)。將免疫濃度取Log值，用Graphpad prism軟件進(jìn)行Log免疫濃度-陽(yáng)轉(zhuǎn)率的劑量曲線擬合，結(jié)果見(jiàn)圖6，曲線擬合參數(shù) R2＞0.95，EC50值為 6.6 μg/ml，曲線擬合較佳，根據(jù)EC50值的大小，可以評(píng)價(jià)該融合蛋白疫苗的細(xì)胞免疫強(qiáng)度。

3 討論

近年來(lái)，在免疫學(xué)研究領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答也逐漸為人們所關(guān)注。在研究細(xì)胞免疫應(yīng)答保護(hù)作用及其機(jī)理方面，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)非常實(shí)用的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)的長(zhǎng)處，能夠分析經(jīng)特異性抗原活化后分泌細(xì)胞因子(如 IFN-γ、TNF-α等)的單個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的頻數(shù)，具有敏感性高，易操作，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，能從2×105～3×105細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明其敏感性比ELISA法高10～200倍［6］，這些獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)都使得 ELISPOT技術(shù)成為國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)抗原反應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法之一。

本研究通過(guò)對(duì)免疫途徑、脾淋巴細(xì)胞濃度、細(xì)胞孵育時(shí)間、抗原刺激濃度等條件的摸索，建立了一種由本公司自制的融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫的IFN-γELISPOT檢測(cè)方法，用以評(píng)價(jià)該融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較皮下、腹腔、肌肉三種注射方式的免疫效果，選擇皮下注射方式作為該疫苗的最佳小鼠免疫方式;合適的脾淋巴細(xì)胞濃度直接影響結(jié)果的判斷，細(xì)胞濃度過(guò)低時(shí)，形成的斑點(diǎn)數(shù)量少，使檢測(cè)的敏感度降低，過(guò)高的細(xì)胞濃度又會(huì)導(dǎo)致背景太深，非特異性干擾增加影響斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，綜合考慮，本研究選擇4×105個(gè)/孔作為脾淋巴細(xì)胞鋪板濃度;細(xì)胞孵育時(shí)間的長(zhǎng)短是本研究重要的影響因素之一，合適的細(xì)胞孵育時(shí)間既要滿足檢測(cè)的敏感度，又要排除非特異性斑點(diǎn)的干擾，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較本研究選擇24～48小時(shí)作為脾淋巴細(xì)胞孵育時(shí)間;抗原刺激濃度是另一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)影響因素，本研究選擇針對(duì)該融合蛋白疫苗特異性刺激肽作為抗原刺激物，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合比較選擇0.5～2μg/孔作為該肽段的刺激濃度范圍，在該濃度范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞形成的斑點(diǎn)數(shù)較多，而對(duì)照組小鼠形成的非特異性斑點(diǎn)低，本底干擾小。以系列梯度稀釋的融合蛋白疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可知，當(dāng)免疫劑量為30μg/ml時(shí)，免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)抗原刺激后，形成的平均斑點(diǎn)數(shù)最高，陽(yáng)轉(zhuǎn)率也最大，以Log免疫濃度-陽(yáng)轉(zhuǎn)率進(jìn)行曲線擬合，可得EC50值，根據(jù)EC50值的大小，可以評(píng)價(jià)該融合蛋白疫苗的細(xì)胞免疫強(qiáng)度。

在ELISPOT數(shù)據(jù)分析方面，常選用兩種分析方法進(jìn)行結(jié)果處理，其中一種為通過(guò)比較不同免疫組的平均斑點(diǎn)數(shù)的多少，判斷藥物細(xì)胞免疫強(qiáng)度;另外一種方法是選擇合適的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算陽(yáng)轉(zhuǎn)率來(lái)評(píng)價(jià)藥物細(xì)胞免疫強(qiáng)度。本文對(duì)兩種數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行了比較，當(dāng)采用平均斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，如果組間小鼠個(gè)體差異不大時(shí)，結(jié)果具有可比性，但是如果同組中有1～2只小鼠給藥后應(yīng)激反應(yīng)較為強(qiáng)烈，形成較多的特異性斑點(diǎn)，這種個(gè)體差異將會(huì)導(dǎo)致平均斑點(diǎn)數(shù)大幅度提高，增加了結(jié)果的變異性，影響組間結(jié)果的判斷。然而采用陽(yáng)轉(zhuǎn)率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，則可以避免因?yàn)闄C(jī)體個(gè)體差異而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差和結(jié)果判斷的不準(zhǔn)確性。因此，選擇一個(gè)合適且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)年?yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)非常重要，一定要結(jié)合實(shí)驗(yàn)自身的情況進(jìn)行大量數(shù)據(jù)分析，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析比較后，再進(jìn)行選擇。

本文建立的ELISPOT方法能夠用于檢測(cè)該融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的特異性IFN-γ，評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫效應(yīng)，該方法操作簡(jiǎn)單，能夠從單細(xì)胞水平上進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)，是一種高效、靈敏、特異的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

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