雙特異性重組腺病毒Ad-HT對肝癌細(xì)胞的體內(nèi)、外抑制效應(yīng)①

劉廣臣 孫大輝 齊延新 王金輝 王卓越 吳 娜 樸秉國 金寧一 李 霄

(吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，長春130021)

自上個(gè)世紀(jì)50年代Caslary發(fā)現(xiàn)新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)爆發(fā)流行使晚期胃癌患者的轉(zhuǎn)移灶受到有效抑制以來，NDV的抗腫瘤作用開始被人們重視，相應(yīng)的科研以及臨床研究開始發(fā)展起來［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，NDV最主要的表面結(jié)構(gòu)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuramidinase，HN)可作為受體發(fā)揮類似于流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性(Neuramidinase activity，NA)裂解唾液酸物質(zhì)以暴露腫瘤細(xì)胞表面信號識(shí)別位點(diǎn)和表面抗原，HN基因還可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)等外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)釋放大量 α 干擾素(Interferon-α，IFN-α)，釋放量比其他細(xì)胞高1 000倍左右，并具有如活化巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和穩(wěn)定活化T細(xì)胞的作用［4］。除此之外，目前已證實(shí)HN蛋白可作為糖蛋白在細(xì)胞膜表面形成獨(dú)特的識(shí)別部位，通過激活機(jī)體免疫發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。由此可見，HN基因在腫瘤基因治療領(lǐng)域具有潛在的巨大的應(yīng)用前景。本課題組利用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子(Human telomerase reverse transcriptase promoter，hTERTp)、人 2 型腺病毒復(fù)制必需基因E1a和HN基因制備了具有腫瘤特異性殺傷和腫瘤特異性復(fù)制功能的雙特異抗腫瘤重組腺病毒Ad-HT，并針對人肺癌、人胃癌和人直腸癌等腫瘤細(xì)胞結(jié)合人胚肺、人肺肝等正常細(xì)胞證明了其特異性［5，6］。本研究旨在利用 Ad-HT探討其對肝癌細(xì)胞的體內(nèi)、外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 重組腺病毒 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和Ad-EGFP由本室構(gòu)建、鑒定并保存［7］;人肝癌細(xì)胞BEL-7402和小鼠肝癌細(xì)胞H22由本室保存;噻唑蘭(3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)、吖啶橙(Acridine orange，AO)、溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)、二脒基苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和羅丹明 123(rhodamine 123，Rho 123)和 2，7-二氯熒光素二乙酸乙酯(2，7-Dichloro Fluorescin Diacetate，DCFA)購自Sigma公司;RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自 Invitrogen公司;蛋白提取試劑盒、BCA檢測試劑盒、Annexin V檢測試劑盒和Caspase檢測試劑盒購自Beyotime公司;C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 MTT檢測［8］于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)制備BEL-7402單層細(xì)胞(5×103)，分別用 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和 Ad-EGFP進(jìn)行感染(設(shè)未感染對照孔)，每種病毒采用3個(gè)感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)劑量(100 MOI、10 MOI和 1 MOI，每個(gè)劑量設(shè)3 個(gè)復(fù)孔)。分別于感染 12、24、36、48、60、72小時(shí)后加入20μl/孔 MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后棄培養(yǎng)液并加入200μl/孔 DMSO，收集溶液并利用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長檢測吸光值(A)。并利用如下公式計(jì)算:細(xì)胞殺傷率=(對照孔A值—實(shí)驗(yàn)孔A值)/對照孔A值。

1.3 熒光檢測［2］于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板制備 BEL-7402單層細(xì)胞(1×106)，分別用100 MOI的 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和Ad-EGFP進(jìn)行感染，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞并重懸于磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)中，分別用 AO/EB 和DAPI進(jìn)行染色，并于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 流式細(xì)胞檢測［8］按1.3所述制備病毒感染細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞并重懸于PBS中，分別用 Annexin V-FITC/PI、Rho 123和DCFA進(jìn)行染色，作用30分鐘后用PBS洗滌3次，沉淀經(jīng)200μl PBS重懸后用流式細(xì)胞儀分析。

1.5 Caspase酶檢測 按1.3所述制備病毒感染細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞并提取總蛋白，利用BCA檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，按Caspase檢測試劑盒說明書進(jìn)行Caspase酶活性檢測。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［8］用Hanks液洗滌并稀釋H22細(xì)胞至1×107個(gè)/ml，于小鼠右后肢皮下注射0.1 ml，待腫瘤結(jié)節(jié)生長至直徑為5 mm視為模型建立。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組(5只/組):第1組為生理鹽水對照組，瘤內(nèi)注射生理鹽水(100μl/只)，每周2次，為期3周;第2組至第5組分別為 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和Ad-EGFP治療組，瘤內(nèi)注射相應(yīng)病毒(109PFU/100μl/只)，每周2次，為期3周。同時(shí)設(shè)正常小鼠對照組，不接受任何處置(未荷瘤，5只)。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察模型動(dòng)物存活情況，數(shù)據(jù)錄入Sigma plot軟件，繪制生存曲線，另外，實(shí)驗(yàn)期間每2天用游標(biāo)卡尺檢測腫瘤長、短徑長，通過公式:(短徑長2×長徑長×0.52)，計(jì)算腫瘤體積。所有實(shí)驗(yàn)組模型動(dòng)物于末次處置后10天處死，采集模型動(dòng)物外周血并分離血清，按試劑盒說明書檢測IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量;采集模型動(dòng)物脾臟并分離T淋巴細(xì)胞，按試劑盒說明書檢測細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)和天然殺傷細(xì)胞(Nature killer cells，NK)活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 學(xué)生氏t檢驗(yàn)用于分析組間差異，Kaplan-Meier檢驗(yàn)用于分析平均生存期。

2 結(jié)果

2.1 Ad-HT對BEL-7402細(xì)胞的抑制作用 如圖1所示，Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和 Ad-EGFP均不同程度地表現(xiàn)出對BEL-7402的抑制作用，且呈現(xiàn)一定的劑效和時(shí)效關(guān)系趨勢，即隨感染劑量的增加和感染時(shí)間的延長，病毒對BEL-7402細(xì)胞的抑制作用隨之增強(qiáng)。但Ad-HN和Ad-EGFP抑瘤作用的量效關(guān)系并不明顯，時(shí)效關(guān)系也僅在高劑量組(100 MOI，48小時(shí)前)有所體現(xiàn)，而Ad-HT和Ad-GT的量效關(guān)系比較明顯，且在各感染劑量均呈現(xiàn)一定的時(shí)效關(guān)系趨勢。就抑瘤效果而言，Ad-HT優(yōu)于Ad-GT、Ad-HN和 Ad-EGFP(P＜0.05)。高劑量組(100 MOI)感染48小時(shí)后，Ad-HT對BEL-7402細(xì)胞的抑制率維持在65%以上，Ad-GT的抑制率在40% ～60%間波動(dòng)。而Ad-HN和Ad-EGFP的抑制率則持續(xù)下降，其中以Ad-EGFP下降最為顯著(P＜0.05)。

2.2 Ad-HT對BEL-7402細(xì)胞形態(tài)的影響 如圖2所示，經(jīng)AO/EB染色，未感染細(xì)胞均呈現(xiàn)亮綠色，而Ad-HN、Ad-HT感染細(xì)胞則部分被染色呈現(xiàn)紅色或橘紅色，并伴有細(xì)胞皺縮等凋亡特征;經(jīng)DAPI染色，未感染細(xì)胞的細(xì)胞核均呈現(xiàn)均勻一致的蘭色，而Ad-HN、Ad-HT感染細(xì)胞的細(xì)胞核則呈現(xiàn)亮蘭色，并伴有核內(nèi)物質(zhì)碎裂等凋亡特征。以上結(jié)果說明，Ad-HN、Ad-HT能夠誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)。

2.3 Ad-HT對BEL-7402細(xì)胞膜及活性氧水平的影響 如圖3所示，Annexin V檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Ad-HN、Ad-HT感染導(dǎo)致BEL-7402細(xì)胞磷脂膜外翻，說明 Ad-HN、Ad-HT感染能夠誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡。另外，Ad-HN、Ad-HT還導(dǎo)致BEL-7402細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potentials，△ψ)下降、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平升高。其中，Ad-HT作用略強(qiáng)于Ad-HN。以上結(jié)果說明，Ad-HN和Ad-HT能夠誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞發(fā)生凋亡，且其作用與線粒體及活性氧密切相關(guān)。

圖1 MTT檢測結(jié)果Fig.1 The results of the MTT assay

圖2 Ad-HT感染對BEL-7402細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Morphological change of Ad-HT-infected BEL-7402 cells

圖3 Ad-HT對BEL-7402 Annexin V、△ψ和ROS的影響Fig.3 Effects of Ad-HT-infected on Annexin V，△ψ and ROS of BEL-7402 cells

2.4 Ad-HT感染對Caspase酶活性的影響 如圖4所示，Ad-HN、Ad-HT均不同程度上調(diào)了Caspase 1、3、6、8酶的活性，其中以 Ad-HT的作用最為明顯(P ＜0.05)。Ad-EGFP 對 Caspase 1、3、6、8 酶的活性無明顯影響，而Ad-GT的作用卻比較明顯(P＜0.05)，幾乎與Ad-HT相當(dāng)，我們認(rèn)為這可能與腺病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞病變有關(guān)。

2.5 Ad-HT對體內(nèi)實(shí)體腫瘤的抑制作用 如圖5所示，雖然實(shí)驗(yàn)后期(24～30天)，Ad-HN和Ad-HT實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤體積小于其它實(shí)驗(yàn)組，但實(shí)驗(yàn)前期(0～24天)各實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤體積差異并不明顯，而且時(shí)常出現(xiàn)波動(dòng)，這可能與模型動(dòng)物死亡導(dǎo)致的平均腫瘤體積異常變化有關(guān)。然而，雖然Ad-HT減緩腫瘤生長速度的作用并不明顯，但其對模型動(dòng)物平均生存期卻有明顯改善作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Ad-HT治療模型動(dòng)物生存率為100%，而生理鹽水對照組、Ad-EGFP和Ad-GP治療組模型動(dòng)物在17～30天內(nèi)相繼死亡。

圖4 Caspase含量比較Fig.4 The content comparison of Caspase

圖5 模型動(dòng)物腫瘤生長趨勢和平均生存期Fig.5 The tumor growth kinetics and the mean survival of animal model

圖6 模型動(dòng)物免疫分析Fig.6 Analysis of immune of the animal model

2.6 Ad-HT對模型動(dòng)物免疫的影響 如圖6所示，與正常對照組、Ad-EGFP實(shí)驗(yàn)組和Ad-GT實(shí)驗(yàn)組相比，在效靶比為50∶1和100∶1時(shí)，Ad-HN和 Ad-HT能夠有效增強(qiáng)模型動(dòng)物CTL和NK活性，其中以Ad-HT作用最為明顯(P＜0.05)。另外，Ad-HN和Ad-HT實(shí)驗(yàn)組IL-2和IFN-γ等Th1類細(xì)胞因子含量明顯高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，而IL-4和IL-10含量差異并不明顯。

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，病人早期常無明顯癥狀和體征，一旦出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期肝癌。其惡性度高、病情進(jìn)展快、治療難度大、療效差、預(yù)后不好已成為其顯著特點(diǎn)。為提高治療的有效率、延長患者的生存期、降低患者的痛苦，人們一直在探索新的治療方向，近年來，針對細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點(diǎn)的相關(guān)研究及試驗(yàn)性治療漸漸走入人們的視線。Apoptin、Suvivin、端粒酶、NDV HN、腺病毒載體等已成為常見的研究對象。雖然其中一些基因與腫瘤間的作用機(jī)制還不完全清楚，但是通過多個(gè)靶點(diǎn)基因作用靶向性治療腫瘤的研究已有報(bào)道［1，2，9］。針對腫瘤細(xì)胞開展多基因聯(lián)合治療，有效的、特異的抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞已成為腫瘤基因治療的一個(gè)重要發(fā)展趨勢。

Fiola等［10］闡明了NDV在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的機(jī)制。NDV的抗腫瘤作用現(xiàn)已被廣泛認(rèn)可，HN蛋白是NDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，以N末端疏水區(qū)與病毒外膜相連，不僅能夠介導(dǎo)受體識(shí)別，還具有水解這些受體中唾液酸成分的神經(jīng)氨酸酶活性。以前的研究表明，HN蛋白在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮佐劑功能，具有活化DC、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，穩(wěn)定活化的T細(xì)胞，刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-12受體的β鏈等作用［1-4］。HN所誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-α還可以上調(diào)一些與抗原識(shí)別、細(xì)胞間作用、細(xì)胞粘附及細(xì)胞毒作用相關(guān)的重要分子［1，11，12］。

目前，腺病毒作為一種候選載體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和研究中已表現(xiàn)出良好的效果，腺病毒載體具有滴度高、感染范圍廣、DNA不整合到宿主染色體、可插入7～8 kb的外源DNA片段等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為基因治療、基因功能研究、反義治療、疫苗開發(fā)等領(lǐng)域最為常用的載體之一［13］。但重組腺病毒污染野生型病毒的問題一直沒有得到很好的解決。本研究選用的重組腺病毒是采用RAPAdⅠ重組腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建的［14］，該系統(tǒng)的基因組骨架質(zhì)粒缺失了腺病毒復(fù)制和包裝相關(guān)信號序列，并將上述序列置于穿梭質(zhì)粒中，使得只有腺病毒基因組骨架質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒重組后，腺病毒才能夠包裝并增殖［13］。因此，應(yīng)用RAPAdⅠ系統(tǒng)所構(gòu)建的重組腺病毒Ad-HT理論上全部經(jīng)過同源重組，這大大降低了野生型腺病毒污染的機(jī)會(huì)［13］。

本研究利用本課題組構(gòu)建的重組腺病毒Ad-HT以及相關(guān)對照病毒 Ad-HN、Ad-EGFP和 Ad-GT，結(jié)合分子生物學(xué)檢測方法，分析了Ad-HT對人肝癌細(xì)胞BEL-7402的抑制作用。結(jié)果顯示，除Ad-EGFP外，Ad-HN、Ad-GP與 Ad-HT同樣具有抑制 BEL-7402腫瘤細(xì)胞的作用，但Ad-HT的抑瘤效果明顯強(qiáng)于其它對照病毒;Ad-HT在高感染劑量(100 MOI)的前提下呈現(xiàn)明顯的時(shí)效關(guān)系趨勢，而在低感染劑量(1 MOI和10 MOI)時(shí)，時(shí)效關(guān)系趨勢不顯著;另外，Ad-HT能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制BEL-7402腫瘤細(xì)胞增殖，而這種抑制作用可能通過影響B(tài)EL-7402細(xì)胞線粒體功能，促進(jìn)其釋放活性氧物質(zhì)，進(jìn)而激活凋亡相關(guān)Caspase酶實(shí)現(xiàn)。雖然Ad-HT對模型動(dòng)物體內(nèi)實(shí)體腫瘤體積的抑制作用并不十分顯著，但卻能有效延長其平均生存期，這可能與Ad-HT的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

綜上，重組腺病毒Ad-HT能夠通過誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7402凋亡抑制其生長。另外，Ad-HT對BEL-7402的凋亡誘導(dǎo)作用可能通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了表達(dá)NDV HN基因抗腫瘤雙特異性重組腺病毒Ad-HT對腫瘤細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)和免疫重建方面的顯著作用?？傊S著對Ad-HT體內(nèi)、外抑癌作用的不斷深入研究，其將會(huì)顯示出廣泛的應(yīng)用前景。

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