壇紫菜蛋白肽的酶法制備及工藝優(yōu)化

陳新峰，張治國，王君虹，周利亙，戴志遠

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江杭州310021;2.浙江工商大學(xué)水產(chǎn)品加工研究所浙江杭州310012)

紫菜富含蛋白質(zhì)、多糖、脂類、維生素和礦物質(zhì)等多種成分，通常干紫菜中含蛋白質(zhì)25%～50%，碳水化合物20%～40%，脂肪1%～3%，灰分7.8%～26.9%，以及大量維生素等[1]。以紫菜蛋白為原料制備的紫菜蛋白肽具有降血壓[2]、抗菌[3]、抗氧化[4]等多種生理活性功能，日益受到人們的廣泛關(guān)注，成為紫菜高值化開發(fā)利用的研究熱點。

浙江是紫菜養(yǎng)殖大省，養(yǎng)殖品種以壇紫菜為主，壇紫菜產(chǎn)量較大，但精深加工率較低，目前大多停留在以烘干為主的初級加工階段，其經(jīng)濟附加值較低。以壇紫菜為原料制備壇紫菜蛋白肽是壇紫菜精深加工高值化利用的有效途徑。本研究以壇紫菜蛋白為原料，采用生物酶法制備壇紫菜蛋白肽，優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并通過體外實驗驗證其部分生物活性，為壇紫菜的高值化開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

壇紫菜蛋白，實驗室自制;3.7萬U·g－1菠蘿蛋白酶、99.0萬U·g－1木瓜蛋白酶，上海海洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;197.6萬U·g－1中性蛋白酶，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;8.7萬U·g－1堿性蛋白酶，諾維信公司產(chǎn)品;127.4萬U·g－1胃蛋白酶、261.3萬U·g－1胰蛋白酶，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)，Sigma公司產(chǎn)品;總膽固醇試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

DK-8D型恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;LXJ-HB型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;ALB-224型電子天平、PB-10型pH計，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;UV-1800紫外分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

壇紫菜蛋白肽制備。將壇紫菜蛋白配制成一定質(zhì)量分數(shù)的溶液，調(diào)整pH、溫度，添加蛋白酶，水解一定時間后，95℃水浴滅酶10 min，4 000 r·min－1離心分離10 min，收集上清液，即為壇紫菜蛋白肽溶液。

1.2.1 商品蛋白酶篩選試驗

對菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，堿性蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶在各自的最適條件下，對壇紫菜蛋白進行酶解，以水解度為指標，篩選酶解效果最好的蛋白酶。

1.2.2 單因素試驗

以胰蛋白酶為壇紫菜蛋白酶解酶，分別以酶比底物[E/S]值，pH值，溫度，時間為試驗因素，選擇最佳試驗條件。

1.2.3 酶解工藝優(yōu)化試驗

以[E/S]值、pH值、酶解時間和酶解溫度為試驗因素，利用L9(34)正交表對胰蛋白酶酶解壇紫菜蛋白工藝參數(shù)進行優(yōu)化研究。

1.2.4 測定項目及方法

蛋白質(zhì)測定采用GB/T 5009.5—2003的方法。

2018年1月24日國務(wù)院辦公廳印發(fā)《關(guān)于改革完善全科醫(yī)生培養(yǎng)與使用激勵機制的意見》(下稱《意見》)，[17]該意見指出，到2020年，城鄉(xiāng)每萬名居民擁有2～3名合格的全科醫(yī)生。足見全科醫(yī)生在未來幾年間的重要性。

水解度測定采用甲醛滴定法[5]。

降血壓活性測定。采用ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)活性抑制率為評判指標，方法參照文獻[6]。

ACE活性的抑制率%=

式中D228為228 nm處測得的吸光值。

降膽固醇活性測定。采用膽固醇在模擬膽汁膠束溶液中的溶解度抑制率為評判指標進行測定，方法參照文獻[7]。

式中:A空白溶液的膽固醇溶解度;B樣品溶液的膽固醇溶解度。

抗氧化活性測定。采用羥自由基清除率為評判指標進行測定，方法參照文獻[8]。

式中:D0為空白對照;Di為肽類提取液的吸光值;Dj為無水楊酸時肽類提取液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

圖1 不同蛋白酶的酶解效果

從圖1可以看出，在供試的6種商品蛋白酶中，胰蛋白酶的酶解效果明顯優(yōu)于其他5種蛋白酶，因此試驗選取胰蛋白酶水解壇紫菜蛋白。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶比底物[E/S]值

在pH值7.0、溫度45℃條件下，分別用不同的[E/S]值酶解5 h，比較E/S對水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 E/S值對水解度的影響

從圖2看出，在壇紫菜蛋白酶解過程中，在酶用量確定的情況下，起始DH隨E/S值升高而升高，當E/S值達到到0.045/3后，DH總體呈平穩(wěn)態(tài)勢，因此E/S值選擇為0.045/3較為適宜。

2.2.2 pH值

在[E/S]值0.045/3、溫度45℃條件下，調(diào)節(jié)不同pH值，分別酶解5 h，然后測定水解度，考察pH值對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對水解度的影響

從圖3看出，起始水解度隨pH值的升高而提升，當pH值達到8時水解度達最高，而后水解度呈快速下降趨勢。認為胰蛋白酶在弱堿性條件下酶活力最強，強酸或強堿環(huán)境可能造成胰蛋白酶的變性從而降低了胰蛋白酶的活力，因此，選擇pH值為8較為適宜。

2.2.3 溫度

在[E/S]值0.045/3、pH值8，設(shè)置不同的溫度條件，分別酶解5 h，測定水解度，考察溫度對水解度的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4看出，在胰蛋白酶酶解壇紫菜蛋白的過程中，起始水解度隨溫度的升高而升高，當達到45℃后，水解度總體呈下降趨勢，且保持基本穩(wěn)定，因此，酶解溫度選擇45℃較為適宜。

圖4 溫度對水解度的影響

2.2.4 時間

在[E/S]值0.045/3，pH值8，溫度45℃條件下，進行不同時間酶解，測定水解度，考察酶解時間對水解度的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶解時間對水解度的影響

從圖5看出，胰蛋白酶酶解壇紫菜蛋白的水解度隨著時間的延長而升高，當時間達到4 h后，增加趨勢趨于緩慢，且?guī)缀醣３植蛔儯虼?，酶解時間選擇4 h較為適宜。

2.3 酶解工藝優(yōu)化

[E/S]值、pH值、酶解溫度和酶解時間4因素3水平對胰蛋白酶水解壇紫菜蛋白的正交試驗結(jié)果見表1。由表1看出，影響胰蛋白酶酶解壇紫菜蛋白水解度的效果主次順序為:酶解溫度＞[E/S]值＞酶解時間＞pH值;其優(yōu)化工藝參數(shù)為:C3A3D3B2，即溫度53℃，[E/S]值0.07/3.5，酶解時間4.5 h，pH值7.5。經(jīng)驗證試驗得到其水解度達到85.13%，大于正交試驗表中任一組合。

2.4 壇紫菜蛋白肽生物活性

經(jīng)最優(yōu)工藝酶解得到的壇紫菜蛋白肽溶液，經(jīng)超濾分離，取一定量的壇紫菜蛋白肽溶液，測定其體外降血壓活性、降膽固醇活性和抗氧化活性。結(jié)果40μL壇紫菜蛋白酶解液的ACE抑制率為87.5%;5 mL壇紫菜蛋白酶解液的膽固醇膠束溶解度抑制率(降膽固醇活性)為69.09%;4 mL壇紫菜蛋白酶解液的羥自由基清除率(抗氧化活性)為38.32%。

表1 胰蛋白酶酶解壇紫菜工藝優(yōu)化結(jié)果

3 小結(jié)

以水解度為指標，對6種商品蛋白酶進行篩選，結(jié)果胰蛋白酶水解壇紫菜蛋白效果最佳。通過正交試驗確定，胰蛋白酶水解壇紫菜蛋白的最優(yōu)工藝參數(shù)為[E/S]值0.07/3.5，pH值7.5，溫度53℃，酶解時間4.5 h，其水解度達到85.13%。

通過體外實驗驗證，經(jīng)最優(yōu)工藝酶解得到的壇紫菜蛋白肽具有良好的降血壓活性(87.5%)、降膽固醇活性(69.09%)和抗氧化活性(38.32%)。其最小作用計量和IC50將在后續(xù)實驗作進一步研究。

[1]郭雷，王淑軍，郝倩，等.紫菜多糖和藻紅蛋白生物活性的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2010，31(6):182－185.

[2]劉淑集，王茵，吳成業(yè)，等.壇紫菜降血壓活性肽的分離純化及分子質(zhì)量測定[J].食品科學(xué)，2011，32(2):213－217.

[3]Ding L，Qin S，Li F，etal.Isolation，antimicrobial activity and metabolites of fungus Cladosporium sp.Associated with red alga Porphyra yezoensis[J].Curr Microbiol，2008，56(3):229－235.

[4]錢曉婕，陳舜勝，付杰.壇紫菜中藻膽蛋白的提取及其抗氧化活性研究[J].中國海洋藥物雜志，2008，27(2):42－45.

[5]吳謀成.食品分析與感官評價[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:77－78.

[6]王茵，劉淑集，吳成業(yè).紫菜降血壓肽酶法制備工藝的優(yōu)化[J].福建水產(chǎn)，2008(4):64－68.

[7]王玲琴，王志耕，方玉明，等.雙酶法制備大豆降膽固醇活性肽的研究[J].大豆科學(xué)，2010，29(1):109－112.

[8]楊方美，王林，胡秋輝.鼠尾藻多糖的制備及其抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2005，26(2):224－227.