熊膽粉微生物限度檢查方法學(xué)驗證

楊務(wù)彬 李元宏 蘭 鴻

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442000

熊膽粉為熊科動物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品，收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第11冊[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度檢查一直采用常規(guī)方法檢驗，根據(jù)《中國藥典》2010年版的要求，對原用的常規(guī)方法進(jìn)行驗證[3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），HH B11 600型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），LRH-150B生化培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠），超凈臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB），四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB），膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL），均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 陽性對照菌

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，均購自四川省食品藥品檢驗所。

1.4 供試品

熊膽粉（購自四川省新鹿藥業(yè)有限公司，批號：091203、091204、091205）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

2.1.1 供試液制備方法1

取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為 1∶10 供試液。

2.1.2 供試液制備方法2

取1∶10供試液25 mL加pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50 mL，混勻，作為1∶20供試液。

2.2 陽性對照菌液的制備

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每1 mL中含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每1 mL中含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每1 mL含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液，備用。

2.3 檢查方法驗證[4]

2.3.1 試驗組

2.3.1.1 常規(guī)法 分別取1∶10供試液1 mL和試驗菌株的菌懸液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)。

2.3.1.2 培養(yǎng)基稀釋法1 分別取1∶10供試液0.2、0.1 mL（0.2、0.1 mL/皿）和試驗菌株的菌懸液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)。

2.3.1.3 培養(yǎng)基稀釋法2 分別取1∶20供試液0.1 mL（0.1 mL/皿）和試驗菌株的菌懸液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)。

2.3.2 菌液組

分別取1 mL試驗菌株（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基混勻，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)，每種菌各制備2個皿。

2.3.3 供試液本底測定

2.3.3.1 常規(guī)法 分別取1∶10供試液1 mL入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)。

2.3.3.2 培養(yǎng)基稀釋法1 分別取1∶10供試液0.2、0.1 mL入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)。

2.3.3.3 培養(yǎng)基稀釋法2 分別取1∶20供試液0.1 mL入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，觀察并計數(shù)。

2.4 回收率測定

2.4.1 常規(guī)法測定

常規(guī)法測定回收率，白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌回收率均高于70%，可采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌、酵母菌計數(shù)；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于70%，說明本品對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用，細(xì)菌檢查不能采用常規(guī)法。見表1。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法測定

2.4.2.1 培養(yǎng)基稀釋法（1∶10供試液，0.2 mL/皿）測定回收率 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌回收率高于70%，枯草芽孢桿菌回收率低于70%；采用培養(yǎng)基稀釋法（1∶10供試液，0.2 mL/皿）不可消除本品對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。見表1。

2.4.2.2 培養(yǎng)基稀釋法（1∶10供試液，0.1 mL/皿）測定回收率 枯草芽孢桿菌回收率低于70%；采用培養(yǎng)基稀釋法（用1∶10供試液，0.1 mL/皿）不可消除本品對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。

2.4.2.3 培養(yǎng)基稀釋法（1∶20供試液，0.1 mL/皿）測定回收率 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3次獨立試驗回收率均高于70%；采用培養(yǎng)基稀釋法（1∶20供試液，0.1 mL/皿）可消除本品對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。見表1。

2.5 控制菌檢查法驗證[5-6]

2.5.1 大腸埃希菌檢查法

分別取1∶10供試液10 mL，加入3瓶100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，其中一瓶加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1瓶100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為大腸埃希菌陽性對照組。按大腸埃希菌檢查法檢驗，結(jié)果見表2。

表1 消除供試品抑菌活性回收率試驗

表2 大腸埃希菌檢查結(jié)果

由表2可知，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌，試驗組檢出大腸埃希菌?？刹捎贸Ｒ?guī)法進(jìn)行本品的大腸埃希菌檢查。

2.5.2 金黃色葡萄球菌檢查法

分別取 1∶10供試液 10 mL，加入 3瓶 100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，其中一瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為金黃色葡萄球菌陽性對照組。按金黃色葡萄球菌檢查法檢驗，結(jié)果見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果

由表3可知，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出金黃色葡萄球菌?？刹捎贸Ｒ?guī)法進(jìn)行本品的金黃色葡萄球菌檢查。

2.5.3 銅綠假單胞菌檢查法

分別取 1∶10供試液 10 mL，加入 3瓶 100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，其中一瓶加入1 mL銅綠假單胞菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取一瓶100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，加入1 mL銅綠假單胞菌菌液（50～100個/mL）作為銅綠假單胞菌陽性對照組。按銅綠假單胞菌檢查法檢驗，結(jié)果見表4。

由表4可知，陰性菌對照組未檢出銅綠假單胞菌，試驗組檢出銅綠假單胞菌?？刹捎贸Ｒ?guī)法進(jìn)行本品的銅綠假單胞菌檢查。

2.5.4 大腸菌群檢查法

分別取1∶10供試液1 mL，加入3管10 mL膽鹽乳糖發(fā)酵管中，其中一管加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一管加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1管10 mL膽鹽乳糖發(fā)酵管，加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為大腸菌群陽性對照組。按大腸菌群檢查法檢驗，結(jié)果見表5。

表4 銅綠假單胞菌檢查結(jié)果

表5 大腸菌群檢查結(jié)果

由表5可知，陰性菌對照組未檢出大腸菌群，試驗組檢出大腸菌群?？刹捎贸Ｒ?guī)法進(jìn)行本品的大腸菌群檢查。

2.5.5 沙門菌檢查法

分別取本品10 g，加入3瓶200 mL營養(yǎng)肉湯中，其中一瓶加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1瓶200 mL營養(yǎng)肉湯，加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為沙門菌陽性對照組，按沙門菌檢查法檢查。結(jié)果提示，陰性菌對照組未檢出沙門菌，試驗組未檢出沙門菌，但沙門菌陽性對照組檢出沙門菌，故不能采用常規(guī)法進(jìn)行本品的沙門菌檢查。所以沙門菌檢查法調(diào)整為：分別取本品10 g，加入3瓶400 mL營養(yǎng)肉湯中，其中一瓶加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1瓶400 mL營養(yǎng)肉湯，加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為沙門菌陽性對照組。按沙門菌檢查法檢驗，結(jié)果見表6。

表6 沙門菌檢查結(jié)果

由表6可知，陰性對照組未檢出沙門菌，試驗組檢出沙門菌?？刹捎门囵B(yǎng)基稀釋法進(jìn)行本品的沙門菌檢查。

3 討論

本品按《中國藥典》2010年版一部（附錄ⅩⅢC）微生物限度檢查法進(jìn)行方法驗證，結(jié)果表明，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制備樣品，可采用培養(yǎng)基稀釋法（1∶20供試液，0.1 mL/皿）進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)；采用培養(yǎng)基稀釋法（400 mL營養(yǎng)肉湯）進(jìn)行沙門菌檢查；采用1∶10供試液的常規(guī)法進(jìn)行霉菌及酵母菌計數(shù)和其他控制菌檢查。筆者曾采用薄膜過濾法進(jìn)行試驗，但因供試品無法濾過，故選用培養(yǎng)基稀釋法。

[1]國家藥典委會.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》[M].11冊.中國醫(yī)藥科技出版社，2011：43.

[2]徐愚聰，王野.熊膽粉的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志，2000，15（3）：200-202.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄 79.

[4]顏棟林，李萍，蘭茜.柴黃片微生物限度檢查法方法驗證[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16（16）：7.

[5]權(quán)明吉，金仁順，樸龍，等.熊膽粉對二甲基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝纖維化的抑制作用[J].世界華人消化雜志，2005，13（20）：88.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄71.