空腸內(nèi)注入ω-3多不飽和脂肪酸對急性胰腺炎大鼠免疫功能的影響

田 明 陳振宙 丁治國 王 廣 孫清露

北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院普外科，北京 100700

多器官衰竭是急性重癥胰腺炎患者死亡的主要原因。早期腸內(nèi)營養(yǎng)支持對保護腸黏膜，促進胃腸道功能恢復(fù)，避免腸內(nèi)細菌、毒素的移位有著重要的作用。使用免疫抑制劑、激素、血液透析濾過炎癥介質(zhì)等來減少炎癥反應(yīng)的措施也得到一定程度的應(yīng)用。ω-3多不飽和脂肪酸是近年得到廣泛重視的新型營養(yǎng)制劑，已有大量的動物實驗和臨床觀察證實其對炎癥的抑制作用。目前國內(nèi)外對急性重癥胰腺炎空腸內(nèi)注入ω-3多不飽和脂肪酸的療效研究并不多。無論是動物實驗還是臨床觀察也只是小樣本的研究，其療效及安全使用劑量仍在摸索中。本實驗通過建立急性重癥胰腺炎大鼠模型，從而觀察空腸內(nèi)注入ω-3多不飽和脂肪酸對急性重癥胰腺炎大鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物均采用雄性Sprague-Dawley大鼠，共計80只，體重250～280 g。腸內(nèi)營養(yǎng)（EN）液采用瑞素（華瑞制藥有限公司），所用魚油及玉米油購自Sigma公司。

1.2 實驗分組

急性胰腺炎（AP）大鼠隨機分為3組，每組20只。即普通腸內(nèi)營養(yǎng)組（急性胰腺炎普通營養(yǎng)組）、普通營養(yǎng)液中添加魚油組（急性胰腺炎-魚油營養(yǎng)組）、普通營養(yǎng)液中添加玉米油組（急性胰腺炎-玉米油營養(yǎng)組），魚油中富含ω-3多不飽和脂肪酸，玉米油無此成分。另20只無急性胰腺炎的正常大鼠作為對照組，抽血檢測相關(guān)指標。

1.3 實驗方法

術(shù)前12 h禁食，3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg體重）腹腔內(nèi)注射麻醉。上腹正中切口進入腹腔，提起胃和十二指腸，顯露出胰腺，辨認膽胰管走向。對照組大鼠僅翻動腸管及胰腺后即關(guān)腹。急性胰腺炎大鼠需用顯微血管夾臨時夾住膽胰管肝門部，以防注射牛磺膽酸鈉時液體流入肝臟。用4號鈍針頭通過腸壁孔插入腸管系膜緣的十二指腸乳頭，并穿入膽胰管。通過1 mL注射器向膽胰管內(nèi)勻速注射3.5%?；悄懰徕c（用藥劑量1 mL/kg，注射速度0.2 mL/min）。所有實驗組大鼠經(jīng)胃造口置入內(nèi)徑1.0 mm硅膠管于空腸上段2.0 cm處。檢查無膽漏，關(guān)腹。術(shù)后第1天禁食但不禁飲，第2天開始分別行腸內(nèi)營養(yǎng)，每天按240 mL/kg給予瑞素；魚油營養(yǎng)組及玉米營養(yǎng)油分別額外給予魚油和玉米油，劑量為0.6 mL/100 g。各組均連續(xù)腸內(nèi)營養(yǎng)至術(shù)后第7天。術(shù)后第7天末，處死大鼠，取外周靜脈血1 mL抗凝，于4℃下離心10 min，轉(zhuǎn)速1 500 r/min。取上清，分裝凍存于-80℃冰箱，集中采用ELISA法 檢 測 IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α 濃 度 和 IL-10/TNF-α變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用方差分析，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 死亡情況

急性胰腺炎-普通營養(yǎng)組死亡4例 （25.0%），急性胰腺炎-魚油營養(yǎng)組死亡4例（25.0%），急性胰腺炎-玉米油營養(yǎng)組死亡5例（33.3%），各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對照組大鼠無死亡。

2.2 外周血細胞因子的變化

IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α 濃度和 IL-10/TNF-α 變化見表1。

由表1可以看出，急性胰腺炎各組IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α濃度與對照組比較，行方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，急性胰腺炎-普通營養(yǎng)組、急性胰腺炎-魚油營養(yǎng)組、急性胰腺炎-玉米油營養(yǎng)組與對照組比較，細胞因子濃度均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。急性胰腺炎-魚油營養(yǎng)組與急性胰腺炎-玉米油營養(yǎng)組、 急性胰腺炎-普通營養(yǎng)組比較，IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α濃度均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IL-10/TNF-α的比值也明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α 濃度和 IL-10/TNF-α 變化（）

表1 IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α 濃度和 IL-10/TNF-α 變化（）

組別 例數(shù) IL-1β（ng/L） IL-18（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L） IL-10/TNF-α急性胰腺炎-魚油營養(yǎng)組急性胰腺炎-玉米油營養(yǎng)組急性胰腺炎-普通營養(yǎng)組對照組16 15 16 20 103.06±19.11 157.33±25.35 164.84±21.37 40.25±10.23 134.84±51.37 203.57±88.81 227.10±95.23 47.48±10.51 87.57±9.07 198.26±21.85 196.35±25.12 29.62±10.20 34.03±10.01 63.77±23.30 69.42±18.96 13.37±3.52 2.60±0.64 3.19±0.68 3.03±0.72 2.51±0.61

3 討論

AP是外科常見急腹癥，輕型易于治療，重癥病情兇險，病死率高，國內(nèi)外報道高達20%以上[1]，對其發(fā)病機制的研究也在不斷進行。1896年，Chiari提出急性胰腺炎的自身消化學說。該學說認為急性胰腺炎的發(fā)病是由于胰酶的提前激活引起胰腺自身消化障礙所致。一直以來，治療急性胰腺炎的基本措施就是抑制胰腺外分泌和胰酶活性[2]。但該學說雖能解釋胰腺炎的腹部癥狀，但無法完全解釋重癥急性胰腺炎的胰外損害。1988 年，Rinderknecht提出了“炎性介質(zhì)”學說[3]，認為急性重癥胰腺炎是一種由局部組織壞死引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。急性胰腺炎時出現(xiàn)胰腺壞死，腹脹、胃腸功能紊亂、腸黏膜屏障功能被破壞導致腸道細菌、毒素移位和內(nèi)毒素血癥。以上原因?qū)е旅庖呦到y(tǒng)激活，誘發(fā)白細胞釋放的大量以促炎因子為主的細胞因子，破壞促炎因子/抑炎因子的平衡，各種血管活性物質(zhì)激活，引起微循環(huán)障礙，最終導致胰腺本身和胰外臟器的損害。

細胞因子是由多種免疫細胞及其他細胞主動分泌的一組小分子量可溶性蛋白及多肽，通過與人體細胞表面特異性受體結(jié)合而發(fā)揮各自的生物活性。細胞因子根據(jù)其功能可以分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子兩大類，生理狀態(tài)下表達極少。當有外界刺激時，免疫系統(tǒng)激活，免疫細胞表達、分泌大量細胞因子[4]。其中，TNF-α、IL-1β均屬一線促炎因子，在急性胰腺炎早期，包括胰腺、肺、肝等臟器均可發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β的表達增強[5]。實驗證明，減少TNF-α、IL-1β的表達水平或抑制TNF-α、IL-1β的功能可以顯著改善急性胰腺炎的預(yù)后[6]。IL-18是近年來得到重視的促炎癥細胞因子，其功能與IL-1β相似，研究表明，外周血清IL-18水平與急性胰腺炎的嚴重程度呈正相關(guān)，有助于判斷急性胰腺炎的預(yù)后。IL-10是目前研究最充分的抗炎因子，由巨噬細胞和Th2輔助淋巴細胞等分泌；IL-10在基因水平抑制腫瘤壞死因子、IL-1等細胞因子的表達[7]，從而抑制炎癥反應(yīng)，減少急性胰腺炎時各臟器的損害。促炎細胞因子和抗炎細胞因子兩者水平的變化在急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中有重要的意義，兩者的對抗決定疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。力爭在早期讓兩者達到一個低水平的平衡狀態(tài)，減輕過度的炎癥反應(yīng)，有利于改善急性胰腺炎的預(yù)后。

ω-3多不飽和脂肪酸來源于深海魚油，主要包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。ω-3多不飽和脂肪酸具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫平衡的作用[8]。ω-3多不飽和脂肪酸抑制炎癥反應(yīng)的機制主要包括以下3個方面：①ω-3多不飽和脂肪酸可以取代細胞膜磷脂中的花生四烯酸，減少細胞膜磷脂中花生四烯酸的含量，而花生四烯酸是PG-2、PG-3、TX-2、TX-3、LT-4、LT-5 等炎癥介質(zhì)的前體，從而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用[9]；②鈣離子是多種細胞因子表達的第二信使，ω-3 PUFA則能增加細胞膜的流動性，抑制細胞膜Na、K-ATP酶的活性，減少細胞內(nèi)鈣離子的濃度，抑制免疫細胞的細胞因子的表達[10]；③細胞因子與細胞表面受體結(jié)合后，信號傳入細胞內(nèi)，通過細胞內(nèi)信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，改變受體細胞的行為。ω-3多不飽和脂肪酸可以抑制Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ，cAMP依賴的蛋白激酶PKA、PKC的活性，從而阻斷細胞因子對受體細胞的作用，抑制炎癥反應(yīng)[11]。

本次試驗通過建立急性胰腺炎大鼠模型，觀察空腸內(nèi)注入魚油對大鼠免疫功能、細胞因子的影響。結(jié)果顯示對于急性胰腺炎大鼠模型應(yīng)用魚油后，血清 IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α濃度水平均較其他試驗組降低；IL-10/TNF-α也明顯降低，接近對照組。提示ω-3多不飽和脂肪酸具有一定的抑制炎癥反應(yīng)的作用和維持抗炎促炎平衡狀態(tài)作用，其臨床療效值得進一步研究和推廣。

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