環(huán)孢素A誘導人胃癌MGC80-3細胞凋亡以及對P糖蛋白表達的影響

黃軍祥，胡詠梅，石 海，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1.消化內(nèi)科、2.科研處，3.安徽省消化系病重點實驗室，安徽合肥 230022)

CsA是由真菌產(chǎn)生的一組環(huán)狀十一肽物質(zhì)常常用于自身免疫性疾病和器官移植時的抗排斥反應［1］。同時，CsA作為第一代MDR逆轉(zhuǎn)劑通過抑制P-gp的表達，聯(lián)合其他多種化療藥物起到了良好抗腫瘤增殖作用，最近的文獻就報道了CsA可以抑制包括23132/87胃癌細胞和SW-403結(jié)腸癌細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞的生長和增殖，并誘導細胞的凋亡［2］。在有關CsA抑制胃癌細胞增殖和誘導凋亡的研究機制中，CsA對人胃癌細胞的生長抑制和誘導凋亡與藥物作用濃度有關，也有研究顯示CsA可通過多種機制(MAPK信號路徑、NK-1受體、κB核因子等)誘導腫瘤細胞的凋亡［2－3］。但是CsA誘導腫瘤細胞的凋亡與P-gp的表達關系尚不什么明確，因此本文為進一步探討在人胃癌MGC80-3細胞中兩者是否存在某種關聯(lián)進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 藥品、試劑和儀器:CsA標準品由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)(批號:130495-200202，純度為98.8%)，溶解于新鮮配制的無菌RPMI1640培養(yǎng)基中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜(美國Pall公司)再次過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。MTT試劑、二甲亞砜(DMSO):美國Sigma公司，P-gp一抗和購自Santa Cruz Biotechnology，INC(美國，進口分裝)，二抗購自北京中杉金橋，內(nèi)參GAPDH購自上?？党?，ECL發(fā)光試劑盒:美國Pierce公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒:上海貝博生物。SPECTRAmax M2e酶標儀:美國Molecular Devices公司，流式細胞儀(BECKMAN COULTER EPICS XL，USA)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人胃癌MGC80-3細胞購自于中國科學院上海細胞庫，生長于含有10%胎牛血清和12 kU·L－1慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37.0°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.3 MTT實驗 MGC80-3細胞經(jīng)胰酶消化收集并稀釋為2×107～4×107·L－1的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，試驗設5個復孔。實驗組加系列稀釋的 CsA溶液，使其終濃度依次為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μmol·L－1，并設 control組。細胞在37°C 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加 5.0 g·L－1的 MTT 20 μl，孵育4 h，吸出全部上清液，再加DMSO 150 μl，振蕩混勻。于酶標儀上檢測490 nm處吸光度(OD)，實驗重復3次。采用公式細胞存活率/%=(實驗組 OD/對照組 OD)×100%，計算CsA處理細胞后不同時間段的存活率。

1.4 AO/EB染色觀察凋亡細胞的形態(tài) 取對數(shù)生長期MGC80-3細胞以濃度為1×108·L－1的活細胞懸液在含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液基中貼壁24 h后，5.0、15.0、25.0 μmol·L－1CsA 作用細胞 48 h，設control組，加入AO/EB染液避光染色約15 min，置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將對數(shù)生長期MGC80-3細胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h，經(jīng)不同濃度CsA作用48h，胰酶收集細胞后冰PBS洗滌兩次，加400 μl 1×Bing Buffer懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109·L－1，在 2 ～8 ℃ 條件下加入 5 μl Annexin V-FITC 孵育15 min，再加 10 μl PI避光孵育5 min，F(xiàn)CM檢測細胞的凋亡率(激發(fā)波長:488 nm)。

1.6 Western blot檢測分析 MGC80-3細胞在濃度為0 ～40.0 μmol·L－1CsA作用48 h后用細胞裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，每孔取20 μl的蛋白上樣，在不同濃度SDS-PAGE凝膠中電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗按1∶100稀釋比例孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，再按1∶50 000比例將辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(二抗)稀釋液孵育膜2 h，PBST洗滌3次，每次10 min，于暗室中ECL發(fā)光試劑進行顯影，掃描儀收集圖像，ImageJ軟件分析灰度值，以IntDen/Area表示蛋白單位面積上的密度，再以P-gp與GAPDH的比值，即為P-gp的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩因素的相關性采用Pearson相關分析。

2 結(jié)果

2.1 CsA抑制MGC80-3細胞的增殖 MTT法結(jié)果顯示，在5.0 ～ 25.0 μmol·L－1濃度范圍 CsA 對胃癌MGC80-3細胞增殖有抑制作用，且呈現(xiàn)時效和量效的依賴性，與control組相比，差異有統(tǒng)計學意義(Fig 1)。

2.2 AO/EB染色 不同濃度CsA處理MGC80-3細胞48 h，AO/EB染色后于熒光顯微觀察，control組細胞形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，呈較均勻一致的綠色，較少見凋亡和壞死細胞，而實驗組細胞間隙增寬，形態(tài)不規(guī)則、收縮變圓，隨CsA作用濃度的增加凋亡細胞明顯增多，晚期凋亡的細胞可見細胞質(zhì)凝聚、固縮，細胞核碎裂等典型的凋亡特征(Fig 2)。

Fig 1 Effects of CsA on the viability of MGC80-3 cells

Fig 2 Effects of CsA on apoptosis of MGC80-3 cells determined by AO-EB staining(×200)

2.3 CsA誘導MGC80-3細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染原理FCM分析CsA誘導MGC80-3細胞凋亡的影響。不同濃度CsA(5.0、15.0、25.0 μmol·L－1)處理MGC80-3細胞48 h后出現(xiàn)不同程度的凋亡，凋亡率隨著藥物作用濃度增加而依次升高(Fig 3)，呈現(xiàn)明顯的劑量效應關系。本實驗重復3次，在雙變量流式細胞儀散點圖上左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，15.0、25.0 μmol·L－1CsA 作用后導致細胞各期凋亡率與control組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。

Fig 3 Inhibitors of P-gp by CsA induced apoptosis in MGC80-3 cells

2.4 CsA影響MGC80-3細胞內(nèi)P-gp的表達 在濃度 5.0 ～ 40.0 μmol·L－1范 圍 內(nèi) CsA 處 理MGC80-3細胞48 h，P-gp表達隨CsA作用濃度的增加而逐漸減弱(Fig 4)，當CsA濃度大于或等于10 μmol·L－1時蛋白表達量與control組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2.5 CsA誘導MGC80-3細胞凋亡與P-gp表達的相關性 Pearson相關分析結(jié)果顯示P-gp的表達與CsA誘導MGC80-3細胞晚期凋亡率呈負相關(r=－0.722，P=0.028)，與總凋亡率也呈負相關(r=－0.718，P=0.029)，而與細胞早期凋亡相關性差異無統(tǒng)計學意義(r=－0.454，P=0.220)。

Fig 4 Inhibitory effect of CsA on the expression of P-gp in MGC80-3 cells(±s，n=4)

3 討論

胃癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在腫瘤患者中位居第2位。全球由癌癥導致死亡的病因中有12%因胃癌引起，在我國胃癌則是腫瘤患者最主要的死因［4－5］。目前針對胃癌患者，特別是進展期胃癌，化療一直是公認的標準治療方法;然而腫瘤細胞固有和后天獲得的多藥耐藥性(MDR)和P-gp的過表達是化療治療胃癌失敗的主要原因之一［6］。CsA可逆轉(zhuǎn)包括P-gp在內(nèi)的多種耐藥蛋白的表達，并增加腫瘤細胞內(nèi)化療藥物的分布，增強抗癌療效［7］，Beppu 等［8］的研究也表明聯(lián)合應用CsA和γ干擾素可明顯誘導胃癌MK-1、GCTM細胞凋亡，但是CsA單獨應用卻無明顯的誘導細胞凋亡作用。

本實驗通過AO/EB、FCM等方法研究發(fā)現(xiàn)單獨使用CsA對人胃癌MGC80-3細胞也具有誘導凋亡作用，細胞早期凋亡率和晚期凋亡率都隨CsA作用劑量的增加而逐漸增加(P＜0.05，P＜0.01);雖然Beppu 等［8］的研究顯示 5.0 μmol·L－1CsA 單獨應用處理胃癌細胞并無明顯誘導凋亡作用，這可能與選擇CsA作用劑量偏低和細胞株的差異有關;Roy等［9］研究也表明高劑量的CsA可誘導細胞活性的喪失和抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，這與本實驗結(jié)果相類似。本研究還顯示CsA對MGC80-3細胞生長和增殖抑制作用與所加藥物呈現(xiàn)時效和量效的依賴關系，和文獻報道的研究結(jié)果基本一致［2］，因此CsA作用于胃癌細胞也表現(xiàn)出良好的抗腫瘤增殖活性。

P-gp的高表達與胃癌惡性程度相關，抑制P-gp表達活性可明顯改善胃癌患者的預后［10］，文獻報道了在胃癌SGC7901/VCR細胞中減少P-gp的表達量可促進細胞的凋亡［6］。實驗結(jié)果表明:CsA處理MGC80-3細胞48 h后，P-gp表達量呈濃度依賴性下降(P ＜0.05，P ＜0.01)，Annexin V-FITC/PI雙染FCM分析數(shù)據(jù)聯(lián)合Western blot檢測表明CsA抑制MGC80-3細胞P-gp表達活性作用越強，誘導細胞凋亡的趨勢越明顯，因此我們推測P-gp表達的變化可能是影響細胞凋亡的重要因素之一。

由于大多數(shù)化療藥物均可通過誘導細胞凋亡抑制腫瘤生長和增殖，因此誘導細胞凋亡是目前臨床用于腫瘤治療的較為理想的治療手段之一［11－12］。然而P-gp的過表達導致對許多化療藥物的普遍耐藥使得腫瘤細胞抗細胞凋亡作用日益突出［13］，本實驗研究了CsA誘導MGC80-3細胞的凋亡和下調(diào)P-gp表達，Pearson相關分析顯示CsA抑制P-gp表達與MGC80-3細胞的凋亡存在相關性，因此P-gp的表達可能參與了CsA誘導細胞凋亡的過程。研究顯示［14］逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性、抑制P-gp的功能和表達促進了胃癌SGC7901/VCR細胞的凋亡，其機制可能與誘導caspase-3活化有關。為此希望在后續(xù)的研究中進一步證實CsA抑制MGC80-3細胞P-gp表達與誘導凋亡的相關機制，為臨床針對多藥耐藥腫瘤，特別是P-gp表達陽性的進展期胃癌，選擇合理的治療方案提供參考和科學依據(jù)。

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