Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)生、醋莪術(shù)對(duì)CYP450酶亞型的影響

王 菊，陸兔林，2，毛春芹，肖永慶，顧娟娟

(1.國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心、國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室、江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val、廣西莪術(shù) Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金 Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，莪術(shù)臨床應(yīng)用廣泛，是一種有很大開(kāi)發(fā)潛力和廣闊市場(chǎng)前景的中藥［1－2］。

在肝臟中含量較高的細(xì)胞色素P450(CYP450)是最重要的藥物代謝酶，藥物進(jìn)入體內(nèi)受CYP450代謝轉(zhuǎn)化，同時(shí)影響CYP450的表達(dá)水平，誘導(dǎo)和抑制其同工酶的活性［3－5］。Cocktail探針?biāo)幬锓軐?duì)多種同工酶同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，省時(shí)，經(jīng)濟(jì)且個(gè)體間差異小，在藥動(dòng)學(xué)研究和臨床合理用藥方面有重大意義［6－7］。

莪術(shù)臨床應(yīng)用廣泛，且臨床上應(yīng)用較多的是醋莪術(shù)。據(jù)大量文獻(xiàn)證明，醋制從增強(qiáng)療效來(lái)看，確與中醫(yī)基本理論相符，但醋莪術(shù)增效的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以茶堿、氨苯酚、氯唑沙宗為探針底物，考察生、醋莪術(shù)對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影響，以探討莪術(shù)醋制前后與醋制增效的相關(guān)性，從而為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)包括:四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器;色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);Anke TGH016C 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);MTN-2800W氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);電子天平(Mettler Toledo AG285);

1.2 藥物與試劑 茶堿(批號(hào):100121－199903);氯唑沙宗(批號(hào):100364－200301);安替比林(批號(hào):100506－200301);以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，用于含量測(cè)定。氨苯酚(購(gòu)自Sigma公司，用于含量測(cè)定)。乙腈為色譜純;乙酸乙酯為分析純;重蒸水為自制。

1.3 提取液的制備 取凈莪術(shù)，參照2010版《中國(guó)藥典》制得生、醋莪術(shù)飲片，粉碎，過(guò)篩(3號(hào))。取生品及醋品適量，分別加15倍量的體積分?jǐn)?shù)為0.90的乙醇加熱回流兩次，提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，制得生、醋莪術(shù)藥液。

1.4 動(dòng)物及給藥方法 ♂性SD大鼠，18只，體質(zhì)量(250±20)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購(gòu)買，合格證號(hào):SCXK(滬)2007一0005。動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、生莪術(shù)組及醋莪術(shù)組。生、醋莪術(shù)組分別單次灌胃給予生、醋莪術(shù)藥液(9 g·kg－1:約為臨床劑量的10倍)，空白組給予同等劑量的生理鹽水。給藥5 min后灌胃給予茶堿(30 mg·kg－1)、氨苯酚(20 mg·kg－1)和氯唑沙宗(50 mg·kg－1)混合探針?biāo)幰?。分別于給藥前 0 h 和 0.05、0.15、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12 和24 h 從眼底靜脈叢采血。4 000 r·min－1離心10 min后取血漿于－20℃保存待用。

1.5 大鼠含藥血漿樣品處理 精密吸取大鼠血漿100 μl，加入內(nèi)標(biāo)液 20 μl，加入乙酸乙酯 800 μl，渦旋震蕩 2 min，14 000 r·min－1離心 10 min，分取有機(jī)相700 μl，氮?dú)獯蹈珊蠹?0%乙腈100 μl溶解。

1.6 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相以乙腈(A)－ 水(B)，洗脫程序:0～10 mim，A為12% ～40%;10～22 min，A為40%;22～24 min，A 為40% ～12%;24～30 min，A為12%。流速1.0 ml·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫 35℃;進(jìn)樣量 10 μl。

1.7 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿100 μl，加入20 μl系列濃度的混合對(duì)照品溶液，使血漿中各化合物的系列濃度分別為茶堿 32.64、26.11、16.32、6.528、3.264、1.306、0.6528 mg·L－1;氨苯酚:32.61、26.09、16.30、6.522、3.261、1.304、0.6522 mg·L－1;氯唑沙宗:16.96、13.57、8.480、3.392、1.696、0.6784、0.3392 mg·L－1。加入 20 μl內(nèi)標(biāo)后，其余操作步驟按“1.5大鼠含藥血漿樣品處理”項(xiàng)下確定的方法進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 茶堿、氨苯酚和氯唑沙宗的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS1.0軟件計(jì)算，各探針的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異以配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 本實(shí)驗(yàn)條件下，3種探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)分離良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定，基線平穩(wěn)。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中的茶堿、氨苯酚、氯唑沙宗的濃度，重現(xiàn)性好。見(jiàn)Fig 1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)結(jié)果，將探針?biāo)幬锖蛢?nèi)標(biāo)的峰面積比值對(duì)探針?biāo)幬锏牧繚舛冗M(jìn)行線性回歸，得回歸方程，茶堿:Y=0.2154X－0.0358，r=0.9982;氨苯酚:Y=0.2849X －0.3008，r=0.9971;氯唑沙宗:Y=0.3642X－0.0398，r=0.9982。

2.3 精密度與提取回收率 考察日內(nèi)與日間精密度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣品，每個(gè)濃度平行5份，隨行同日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得精密度，結(jié)果表明日內(nèi)和日間精密度均小于15%。同時(shí)測(cè)得探針?biāo)幬锏奶崛』厥章史謩e為:茶堿(83.0±2.5)%、氨苯酚(76.0±6.7)%、氯唑沙宗(90.1±4.5)%。

2.4 穩(wěn)定性考察 本實(shí)驗(yàn)考察了血漿樣品在室溫下放置24 h、3個(gè)凍融循環(huán)后的樣品穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)茶堿、氨苯酚及氯唑沙宗的血漿樣品在室溫下放置24 h及反復(fù)凍融3次后測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

Fig 1 Chromatograms of the assay

2.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.5.1 3種探針?biāo)幬锏乃帲瓡r(shí)曲線 大鼠灌胃生、醋莪術(shù)后，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得3種探針?biāo)幬锏难帩舛?，結(jié)果見(jiàn)Fig 2。由Fig 2可知，大鼠給予生莪術(shù)后，氨苯酚及氯唑沙宗的Cmax有所降低，但與空白組差異無(wú)顯著性。茶堿的Cmax雖明顯增大但其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)變化;大鼠給予醋莪術(shù)后，茶堿與氨苯酚的Cmax明顯降低。結(jié)合其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生莪術(shù)對(duì)3種亞型酶活性影響并不明顯，醋莪術(shù)對(duì)CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，對(duì)CYP3A4具有誘導(dǎo)作用。

2.5.2 3種探針?biāo)幬锏乃巹?dòng)學(xué)參數(shù) 茶堿、氨苯酚和氯唑沙宗的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)中國(guó)藥理學(xué)會(huì)推薦的DAS1.0程序處理，3種探針?biāo)幍乃巹?dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)Tab 1。

Fig 2 Pharmacokinetic profile of probe drugs in plasma

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of three probe drugs(n=6)

單次給以大鼠生、醋莪術(shù)后，生莪術(shù)的茶堿、氨苯酚和氯唑沙宗的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與空白組相比差異沒(méi)有顯著性;但醋莪術(shù)與空白組相比，茶堿的、Tmax和AUC明顯增加，Cmax、CL/F明顯降低;氨苯酚的變化不明顯，AUC明顯降低，CL/F明顯增加;氯唑沙宗的、Tmax、AUC 明顯增加，CL/F 明顯降低。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生莪術(shù)對(duì)3種亞型酶活性影響并不明顯，這可能與單次給藥有關(guān)。醋莪術(shù)對(duì)CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，對(duì)CYP3A4具有誘導(dǎo)作用。莪術(shù)臨床應(yīng)用廣泛，但中醫(yī)臨床上應(yīng)用較多的是醋莪術(shù)，通過(guò)炮制改變藥物代謝酶的活性，因此在臨床上使用醋莪術(shù)時(shí)，合并使用經(jīng)CYP1A2、CYP3A4和 CYP2E1代謝的藥物，應(yīng)充分考慮其給藥劑量對(duì)合用藥物代謝的影響，必要時(shí)應(yīng)注意調(diào)整合用藥物的給藥劑量，從而為臨床制定合理的給藥方案提供依據(jù)，將可能出現(xiàn)的不良代謝性藥物相互作用降到最低程度。

本實(shí)驗(yàn)采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄑ芯苛松?、醋莪術(shù)對(duì)大鼠CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1這3種亞型的酶的作用并進(jìn)行比較，為聯(lián)合給藥時(shí)給藥方案的制定提供理論支撐，為探討莪術(shù)醋制增效的機(jī)制提供一定依據(jù)，并很好的指導(dǎo)臨床安全、有效、合理用藥。

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