BAPTA-AM對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

施水娟，宋必衛(wèi)

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310014)

肝功能衰竭(hepatic failure，HF)是一種涉及多器官的臨床綜合征，由大面積的肝細(xì)胞死亡引起，很快發(fā)生多臟器功能衰竭，死亡率高達(dá)60% ～90%。目前臨床無有效治療藥物。肝腎綜合征(hepatorenal syndrome，HRS)是在嚴(yán)重肝病時(shí)發(fā)生的急性腎功能衰竭，是HF的重要并發(fā)癥與死亡原因。HRS加重病情，使治療更復(fù)雜。理論上，一個(gè)藥物對(duì)肝、腎細(xì)胞均有強(qiáng)力保護(hù)作用，則用于治療HF更佳:既治療原發(fā)病，又能改善并發(fā)癥。我們發(fā)現(xiàn)進(jìn)入細(xì)胞后活化的高效鈣絡(luò)合劑 BAPTA-AM［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N＇N＇-tetraacetic acid］對(duì)肝細(xì)胞有很強(qiáng)的保護(hù)作用，有望開發(fā)成肝衰的治療藥［1－2］。

D-氨基半乳糖(D-galactosmine，D-GalN)誘導(dǎo)急性肝損傷模型是目前公認(rèn)最好的模擬病毒性肝炎病理變化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。本文以D-GalN攻擊腎小管細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)以模擬肝腎綜合癥時(shí)的腎細(xì)胞損傷，通過測(cè)定細(xì)胞活力，線粒體膜電位(△Ψm)，凋亡通路關(guān)鍵酶 Caspase-8、Caspase-9的激活等指標(biāo)評(píng)價(jià)D-GalN對(duì)腎細(xì)胞的毒性和BAPTA-AM的對(duì)腎細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，探討其對(duì)肝腎綜合癥的有益影響，進(jìn)一步論證BAPTAAM的治療學(xué)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 MDCK細(xì)胞株購自 American tissue culture center(ATCC);D-GalN購自重慶醫(yī)科大學(xué);BAPTA-AM 購自 Gibco公司;Rhodamine123、MTT、A23187、Fura-2/AM購自Sigma公司;Annexin V-EGFP、Hoechst33342/PI購自南京凱基生物技術(shù)有限公司;Caspase-8、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒購自海門市碧云天生物技術(shù)研究所;MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS購自上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 垂直流超凈臺(tái)(ESCO);CO2培養(yǎng)箱(Forma 3111);倒置熒光顯微鏡(Leica Devices);酶標(biāo)儀(Molecular Devices，Spectramax M2e);離心機(jī)(Heraeus，LDZ5-2)。

1.2 方法

1.2.1 D-GalN誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞損傷模型的建立將MDCK細(xì)胞以104/孔接種于96孔板，MEM培養(yǎng)液，5%CO2，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞生長到70% ～80%孔面積。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。正常對(duì)照組不作處理。模型組加入不同濃度D-GalN，再培養(yǎng)6 h。各孔均加入終濃度0.5 g·L－1的MTT，37℃孵育4 h后DMSO溶解，用酶標(biāo)儀(λ=570 nm)測(cè)吸光度，選擇適當(dāng)濃度造模。

1.2.2 BAPTA-AM 對(duì) D-GalN誘導(dǎo) MDCK細(xì)胞損傷的影響 細(xì)胞分5組，每組6個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組不作處理;D-GalN模型組加入D-GalN(20 mmol·L－1)，用藥各組在D-GalN攻擊前30 min時(shí)加入相應(yīng)濃度的BAPTA-AM。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.3 Annexin V-EGFP/PI、Hoechst33342/PI 染色［4］以5×104/孔接種細(xì)胞于24孔板，分組處理同“1.2.2”。D-GalN攻擊6 h后棄培養(yǎng)液并用PBS清洗細(xì)胞兩遍，分別加入Annexin V-EGFP、PI，室溫避光反應(yīng)5 min，或hoechst33342、PI(終濃度均為1 mg·L－1)室溫避光反應(yīng)30 min，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 △Ψm 的檢測(cè)［5－6］Rh 123 為膜電位敏感的熒光染料，能選擇性地在活細(xì)胞線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出黃綠色熒光，其強(qiáng)度可間接反映△Ψm水平。細(xì)胞分組與處理同“1.2.2”，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。棄培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，加含10 mg·L－1Rh 123的無血清培養(yǎng)基中37℃孵育30 min后移棄Rh 123，PBS清洗多次至背景較淺，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi) Caspase-8、Caspase-9 活性檢測(cè)［7］基于Caspase-8、Caspase-9分別特異性催化底物Ac-IETD-pNA、Ac-LEHD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA，通過于405 nm測(cè)定pNA吸光度檢測(cè)Caspase-8、Caspase-9的活性。接種于細(xì)胞6孔板中，分組與處理同上，收集細(xì)胞按照每200萬細(xì)胞加入100 μl的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴下裂解15 min，4℃離心(15 000 r·min－1)15 min，取上清液按試劑盒說明檢測(cè)。

1.2.6 A23187/CaCl2拮抗實(shí)驗(yàn)［8］Ca2+載體A23187促進(jìn)Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)形成Ca2+超載損傷。以104/孔接種細(xì)胞于96孔板，分組同“1.2.2”。用藥各組分別加入相應(yīng)濃度的BAPTA-AM培養(yǎng)30 min后，模型組和BAPTA-AM各組分別加入CaCl20.4 g·L－1和不同濃度的 A23187(0.01 ～ 100 μmol·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，MTT法測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.7 ［Ca2+］i的測(cè)定 分組及 D-GalN攻擊同上。用無血清無酚紅的MEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次。加入終濃度為 5 μmol·L－1的 Fura-2/AM，37℃避光溫育30 min，用無血清無酚紅的MEM培養(yǎng)液清洗3次以去除多余的Fura-2/AM。設(shè)定激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長510 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。再加入0.4%的Triton X-100及5 mmol·L－1CaCl2后測(cè)定最大熒光強(qiáng)度值Fmax，在Fmax的基礎(chǔ)上加入10 mmol·L－1EGTA后所測(cè)定最小熒光強(qiáng)度值Fmin。按以下公式計(jì)算［Ca2+］i:Kd(F－Fmin)/(Fmax－F);Fura-2 與 Ca2+的解離常數(shù) Kd=224 nmol·L－1。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)處理 用GraphPad Prism軟件處理，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 D-GalN誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞損傷模型的建立D-GalN攻擊6 h，細(xì)胞活力隨著D-GalN濃度升高呈指數(shù)衰減(Fig 1)。當(dāng)D-GalN濃度為20 mmol·L－1時(shí)，細(xì)胞活力降低至50.9%，故以該濃度D-GalN攻擊6 h制備MDCK細(xì)胞損傷模型。

Fig 1 Inhabitory effect of D-GalN on viabilities of MDCK cells detected with MTT method(±s，n=6)

2.2 BAPTA-AM明顯提高M(jìn)DCK細(xì)胞活力 結(jié)果見Fig 2。BAPTA-AM濃度依賴性地減輕細(xì)胞損傷，在 5 nmol·L－1時(shí)作用最佳(活力為 84.6%)，再增大劑量則作用減弱，提示用藥不可過量。

Fig 2 BAPTA-AM protected MDCK cells from D-GalN induced injury(±s，n=6)

2.3 BAPTA-AM抗細(xì)胞凋亡作用 膜磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻、染色質(zhì)凝集是細(xì)胞凋亡重要特征。Annexin V-EGFP選擇性結(jié)合外翻的PS，使凋亡細(xì)胞綠染。碘化丙啶(Propidium Io-dide，PI)可進(jìn)入凋亡中晚期或壞死細(xì)胞使細(xì)胞核紅染，兩者配合使用可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開。Hoechst 33342是一種可穿透細(xì)胞膜的核熒光染料，活細(xì)胞核呈彌散均勻藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核則呈致密熒光。

現(xiàn)有研究從宏觀、中觀和微觀不同視角對(duì)金融結(jié)構(gòu)影響產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級(jí)的機(jī)理進(jìn)行了深入分析，而在各不同傳導(dǎo)途徑中技術(shù)進(jìn)步都扮演著非常重要的角色。主要表現(xiàn)為以下三個(gè)方面：(1)在合理高效的金融結(jié)構(gòu)下，資金向著收益率高的部門流動(dòng)，資金集聚與導(dǎo)向提供激勵(lì)，促進(jìn)技術(shù)進(jìn)步，從而產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)得以優(yōu)化提升；(2)國際技術(shù)轉(zhuǎn)移尤其是技術(shù)引進(jìn)推動(dòng)了我國經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，其中金融結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要的作用；(3)金融結(jié)構(gòu)通過刺激“企業(yè)家精神”、影響企業(yè)的融資約束等因素，影響企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)高度化。

D-GalN處理后，大量細(xì)胞被Annexin V-EGFP綠染，細(xì)胞皺縮，膜泡形成，部分細(xì)胞碎裂(Fig 3A)，Hoechst 33342染色顯示胞核縮小，呈致密濃染(高亮)(Fig 3C)，呈典型的凋亡特征變化。部分細(xì)胞雙重著色(凋亡中晚期)，少量細(xì)胞紅染(壞死)。BAPTA-AM有明顯的抗凋亡作用，濃度為5 nmol·L－1時(shí)作用最佳(Fig 3B)。

2.4 BAPTA-AM抑制D-GalN所致的△Ψm崩潰由Fig 4可見，D-GalN處理6 h使MDCK細(xì)胞線粒體攝取Rh123能力降至正常細(xì)胞的21.4%，出現(xiàn)ΔΨm崩潰。BAPTA-AM濃度依賴性維持ΔΨm，表明BAPTA-AM能有效保護(hù)線粒體，穩(wěn)定ΔΨm，維持膜功能，最佳濃度為5 nmol·L－1。

2.5 BAPTA-AM抑制Caspase-8、Caspase-9激活Caspase-8、Caspase-9的活性可反映死亡受體和線粒體凋亡通路的激活程度。由Fig 5可知模型組Caspase-8、Caspase-9活性均約為正常對(duì)照組的2倍。BAPTA-AM對(duì)Caspase-8、Caspase-9激活均有明顯抑制作用，對(duì)后者抑制作用尤強(qiáng)，5 nmol·L－1時(shí)幾乎完全抑制其激活。

2.6 BAPTA-AM抑制A23187/CaCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷 A23187誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致細(xì)胞損傷。由Fig 6可知，細(xì)胞活力隨著A23187濃度的升高而降低。BAPTA-AM濃度依賴性提高細(xì)胞活力，5 nmol·L－1時(shí)效果最佳。

2.7 BAPTA-AM降低［Ca2+］iD-GalN損傷MDCK細(xì)胞后，［Ca2+］i較正常對(duì)照組明顯升高。BAPTA-AM劑量依賴性降低［Ca2+］i，其濃度為50 nmol·L－1時(shí)，［Ca2+］i達(dá)到(149.62 ± 28.41)nmol·L－1，與正常對(duì)照組相當(dāng)，證明BAPTA-AM能完全取消鈣超載。

3 討論

D-GalN是常用的肝毒劑。D-GalN與LPS(內(nèi)毒素)合用，促進(jìn)TNF-α生成，通過死亡受體通路誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡，致鼠急性HF［3］。一般認(rèn)為D-GalN干擾半乳糖代謝，導(dǎo)致三磷酸尿苷耗竭，抑制RNA和蛋白質(zhì)合成。然而D-GalN的確切毒性機(jī)制尚不清楚。本課題組證明D-GalN通過鈣超載損傷肝細(xì)胞，致大量細(xì)胞凋亡，少量細(xì)胞壞死［1］。本文發(fā)現(xiàn)D-GalN攻擊 MDCK細(xì)胞后，［Ca2+］i明顯升高，細(xì)胞活力下降，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征性改變(Fig 3)，細(xì)胞凋亡通路激活(Fig 5)和ΔΨm崩潰，充分證明D-GalN能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死，線粒體是其作用的靶細(xì)胞器，該結(jié)果與人胚肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致［1］。

Fig 3Morphological analysis of MDCK cells by Annexin V-EGFP/PI or Hoechst 33342/PI double staining(±s，n=6)

Fig 4 Inhibition of BAPTA-AM on dissipation of the ΔΨm of MDCK cells by DGalN attack(±s，n=6)A:ΔΨm was labeled with rhodamine123 and detected by fluorescence microscope;B:Bar graph:quantitative analysis of the mean fluorescent intensity(MFI)analyzed by Image J software.##P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs model group

Fig 5BAPTA-AM blocked activation of caspase-8 and caspase-9 in MDCK cells attacked by D-GalN(±s，n=3)

Fig 6 BAPTA-AM prevented MDCK cells from the injury of ionophore A23187 combined with CaCl2of 0.4 g·L-1(±s，n=6)

Fig 7 BAPTA-AM attenuated cytoplasmic free Ca2+concentrations in MDCK cells attacked by D-GalN(±s，n=6)

一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡存在兩條主要信號(hào)通路:線粒體通路死亡受體通路。細(xì)胞凋亡與Ca2+超載密切相關(guān)。Ca2+超載使線粒體內(nèi)膜形成通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，膜通透性高，造成線粒體腫脹，ATP耗竭，ΔΨm崩潰，引起細(xì)胞凋亡和壞死［9］。同時(shí)線粒體外膜形成大孔徑的凋亡誘導(dǎo)孔(mitochondrial apoptosis-inducedchannel，MAC)，細(xì)胞色素C(CytC)經(jīng)此通道釋放到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活 Caspase-9，始動(dòng)下游Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)［10］，完成凋亡。我們系列工作證明D-GalN通過Ca2+超載損傷線粒體，使MPTP開放，ΔΨm 崩潰，CytC 釋放［2］，激活 Caspase-9(Fig 5)，即通過線粒體通路引起細(xì)胞凋亡。Caspase-8是死亡受體通路的起始者。本文發(fā)現(xiàn)D-GalN也能使Caspase-8激活(Fig 5)，提示其對(duì)死亡受體通路有易化作用。該結(jié)果有助于理解D-GalN與LPS協(xié)同誘發(fā)急性HF，但其確切分子機(jī)制尚待研究。

細(xì)胞死亡機(jī)制復(fù)雜，涉及的信號(hào)通路和信號(hào)分子很多，僅阻斷某一環(huán)節(jié)對(duì)改善全局幫助不大。而Ca2+超載在多環(huán)節(jié)參與細(xì)胞死亡信號(hào)過程。理論上，直接降低［Ca2+］i，迅速消除 Ca2+超載，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，可在多環(huán)節(jié)協(xié)同產(chǎn)生高效有益作用，是目前最佳可選策略。由于Ca2+可經(jīng)多種通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、內(nèi)源儲(chǔ)庫釋放、直接通過損傷的膜等多種途徑進(jìn)入細(xì)胞［11］，故鈣通道阻滯劑療效不佳。

BAPTA-AM是一種快速高效的細(xì)胞內(nèi)Ca2+絡(luò)合劑，有效控制 ［Ca2+］i，消除 Ca2+超載［12］。本文工作表明，BAPTA-AM對(duì)腎細(xì)胞有強(qiáng)力保護(hù)作用，能減少細(xì)胞凋亡與壞死，大大降低細(xì)胞死亡率。該藥通過消除Ca2+超載保護(hù)線粒體，穩(wěn)定ΔΨm，抑制主要凋亡通路激活而產(chǎn)生強(qiáng)大的抗凋亡作用。由Fig 3(雙重?zé)晒馊旧?可見，BAPTA-AM大大減少凋亡;即使少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，也是處于早期(膜PS外翻)，幾乎見不到中晚期凋亡與壞死細(xì)胞。膜PS外翻是可逆轉(zhuǎn)的改變［13］，處于此期的細(xì)胞尚可挽救。該結(jié)果與肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［1－2］。

BAPTA-AM的濃度－效應(yīng)曲線特點(diǎn)是存在最佳劑量，超過該劑量則作用減弱，故應(yīng)注意控制劑量。該現(xiàn)象的機(jī)制尚不清楚?？紤]到5 nmol·L－1時(shí)，BAPTA-AM能明顯降低［Ca2+］i但尚未降至正常對(duì)照水平，此時(shí)效果最佳;而 50 nmol·L－1時(shí)［Ca2+］i與正常對(duì)照組相當(dāng)(Fig 7)但藥效有所降低，表明藥效降低并非［Ca2+］i過度下降所致。由此我們提出一種新觀點(diǎn):如同適度的炎癥、發(fā)熱有助于機(jī)體康復(fù)一樣，細(xì)胞受到損傷性刺激時(shí)，［Ca2+］i適度升高是一種有益的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)，取消這種反應(yīng)導(dǎo)致療效減弱;［Ca2+］i過度升高則導(dǎo)致嚴(yán)重危害反應(yīng)，必須控制。

我們還發(fā)現(xiàn)，BAPTA-AM對(duì)腦細(xì)胞有很強(qiáng)的保護(hù)作用(待發(fā)表)。這些結(jié)果表明BAPTA-AM是一種很有希望的HF治療藥，不僅護(hù)肝，還能對(duì)其嚴(yán)重并發(fā)癥肝腎綜合癥和肝性腦病的產(chǎn)生良好影響，也可能用于腎、腦梗死的治療。該藥作為抗細(xì)胞死亡、搶救瀕危細(xì)胞藥物，有極佳的研發(fā)前景。

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