川續(xù)斷皂苷Ⅵ誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的研究

武密山，趙素芝，任立中，王 茹，白 霞，韓紅偉，李 彬

(1.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室，河北石家莊 050091;2.石家莊市橋東區(qū)醫(yī)院，河北石家莊 050041;3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科，河北石家莊 050031;4.河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，河北石家莊 050017)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesonchymal stem cells，MSCs)是理想的組織工程種子細(xì)胞［1］。骨髓組織除含有造血干細(xì)胞外，還含有MSCs，早期分離培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其形狀呈成纖維細(xì)胞樣而稱(chēng)為成纖維細(xì)胞集落形成單位(colony-forming unit-fibroblastic，CFU-F)，或骨髓基質(zhì)成纖維細(xì)胞(marrow stromal fibroblastic，MSF)，又因其來(lái)自骨髓基質(zhì)而稱(chēng)為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。近年來(lái)因其在不同誘導(dǎo)條件下，具有向中胚層組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化的能力，又稱(chēng)其為間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)祖細(xì)胞(mesenchymal progenitor cells，MPC)或骨源性干細(xì)胞(osteogenic stem cells，OSC)［2］。骨組織由細(xì)胞和骨基質(zhì)組成，各種病因造成的骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)都表現(xiàn)為破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)溶解基質(zhì)形成骨洞的作用超過(guò)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)形成基質(zhì)填充骨洞的作用。前期研究表明，由川續(xù)斷組成的補(bǔ)腎復(fù)方在抑制骨量丟失，改善骨密度方面有明顯療效［3－5］，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)續(xù)斷可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，提高成骨細(xì)胞的活性和數(shù)量，促進(jìn)基質(zhì)鈣化、骨痂生長(zhǎng)等途徑防治骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合［6］。2010年《中國(guó)藥典》指定川續(xù)斷皂苷Ⅵ(akebia saponin D，ASD)為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷 Dipsacus asper Wall.ex Henry的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，目前國(guó)內(nèi)外ASD對(duì)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子α-1(Cbfα1)mRNA表達(dá)影響的研究較少。深入開(kāi)展ASD誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的研究，對(duì)于研究川續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑、藥物與動(dòng)物 噻唑藍(lán)、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(日本 Wako公司)，胰蛋白酶(Sigma USA)，Collagenase type Ⅱ(Worthington，USA)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，α-minimal essential medium(α-MEM，Gibco，USA)，胎牛血清(Hyclone 公司)，考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。川續(xù)斷皂苷Ⅵ(akebia saponin D，ASD批號(hào):110728-201002，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1)，ASD用PBS溶液溶解后，調(diào) pH至7.2～7.4，濾膜過(guò)濾除菌，－4℃密封保存，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。6周齡SD大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。Northern blot增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(PIERCE)，RT-PCR試劑盒與RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)，RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP和Trizol總RNA提取試劑盒均為 MBI公司產(chǎn)品，Cbfα1 ELISA 試劑盒(ADL，USA)，Cbfα1和 GAPDH 引物由 Invitrogen公司合成，Cbfα1 引物序列:上游 5'-ATGCTTCATTCGCCTCACAAAC-3'，下 游 5'-CCAAAAGAAGCTTTGCTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為261 bp。內(nèi)參GAPDH引物序列:上游 5'-GACTACCTCATGAAGATCCT-3'，下游5'-GCGGATGTCCACGTCACACT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為313 bp。

Fig 1 Chemical structure of Akebia saponin D

1.1.2 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó) SHELL LAB)，96 孔培養(yǎng)板(Costar，USA)，35 mm 組織培養(yǎng)皿(Corning-Costar，NY，USA)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，UV 1601紫外分光光度計(jì)(日本島津)，DYY-Ⅲ-7 B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀(北京六一儀器廠)，PCR 擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR System 2400，美國(guó))，Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO RAD)，美國(guó)MIS-2000 SP型3 Y顯微圖像分析儀，3 Y分析軟件(Pro，Ver，4.0)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)［7］并作改進(jìn)，選用6周齡健康SD大鼠，頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下分離股骨脛骨，切去骨兩端，用含 15%FBS、100 kU·L－1青霉素 G、100 mg·L－1硫酸鏈霉素的α-MEM(含酚紅)沖洗骨髓腔得到骨髓細(xì)胞懸液，1 000 r·min－1，離心10 min，棄上清。用L-DMEM重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液貼壁輕輕加入到預(yù)置等體積淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)的離心管中，2 000 r·min－1，離心 30 min。收集云霧狀白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，用L-DMEM洗滌兩次(1 000 r·min－1，離心 5 min)，用含 10% 新生小牛血清、1×105U·L－1青霉素、1 ×105U·L－1鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基重懸。以1×108·L－1接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，于飽和溫度37℃、pH 7.2條件下培養(yǎng)于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。5 d時(shí)首次換液，以后每周換液兩次，根據(jù)細(xì)胞貼壁性能不同，每次換液棄除懸浮生長(zhǎng)的造血系細(xì)胞，每次傳代用0.25%胰蛋白酶(0.1 ml·cm－2)消化2 min，將 MSCs與混雜的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞分開(kāi)，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代擴(kuò)增，使MSCs得到純化。然后將MSCs培養(yǎng)條件改為無(wú)酚紅α-MEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行以下分組，供實(shí)驗(yàn)待用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組 實(shí)驗(yàn)共分 4組:對(duì)照組(control，無(wú)酚紅α-MEM)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ用無(wú)酚紅α-MEM 培養(yǎng)液稀釋成以下低(L-ASD，0.1 μmol·L－1)、中(M-ASD，1 μmol·L－1)、高(H-ASD，10 μmol·L－1)不同濃度培養(yǎng)組，每組藥物濃度均設(shè)8個(gè)平行孔。

1.2.3 大鼠骨髓MSCs的生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 各組細(xì)胞用質(zhì)量濃度為0.25 g·L－1胰蛋白酶消化，1×108·L－1接種于96孔板，每天各取8孔計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)5次，計(jì)算均值，連續(xù)8 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪生長(zhǎng)曲線(xiàn)。計(jì)算群體倍增時(shí)間:TD=t［log 2/(log Nt－ log No)］，No 和 Nt分別代表接種后和培養(yǎng)t小時(shí)的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)活性測(cè)定 將各組MSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中細(xì)胞在第4，5，6天時(shí)用 PBS洗滌細(xì)胞2次，0.04 g·L－1蛋白酶 E(含 1.25 mmol·L－1EDTA)，消化并收集細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)ALP活性測(cè)定底物為9×10－2mol·L－1pNPP，反應(yīng)液 pH 為 10.3，37℃反應(yīng) 30 min，加0.1 mol·L－1NaOH終止反應(yīng)，400 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。ALP 活性表示為 mmol·L－1·min－1·g－1Pro。

1.2.5 骨鈣素(osteocalcin，OC)檢測(cè) 試驗(yàn)方法及藥物和濃度同1.2.4，每組各設(shè)8孔，各組分別誘導(dǎo)至第4，5，6天時(shí)，分別取培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞的骨鈣素含量測(cè)定，采用雙抗夾心ELISA法。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其濃度，以μg·L－1表示，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 RT-PCR 法檢測(cè) Cbfα1 mRNA 表達(dá) ① 組織總RNA提取:采用異硫氰酸胍－苯酚－氯仿一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，A260/A280均在1.8～2.0。總RNA濃度=OD260值×8(g·L－1)，用前調(diào)整濃度至 1 g·L－1。② 反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT):所提取總 RNA 1 μl加入0.5 μl Oligt dT(500 mg·L－1)，離心混勻后加入:dNTP(mix)2 μl，5 × buffer 6 μl，R Nase Ribonuclease Inhibitor 1 μl，AMV-RT 1 μl，無(wú)菌 DEPC 水 8.5 μl，反應(yīng)體系為 20 μl，振蕩混勻，42℃ 60 min，90℃ 5 min，4℃ 5 min。③ PCR 反應(yīng):2 × Primer 2 μl，Taq聚合酶 buffer 2.5 μl，Taq 聚合酶 0.5 μl，dNTP 2 μl，樣本模板 2 μl，DEPC 水 16 μl，總反應(yīng)體積為 25 μl。④ PCR擴(kuò)增條件:Cbfα1:94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min共30個(gè)循環(huán)。β-actin:94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min共25個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，4℃保存。⑤ 瓊脂糖凝膠電泳:取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl與溴酚藍(lán)上樣緩沖液2 μl混合后行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中分析基因條帶的光密度值，并求出與內(nèi)參照基因GAPDH的光密度比值。

2 結(jié)果

2.1 各組成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 各組生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖形基本相似，經(jīng)過(guò)1～3 d的潛伏適應(yīng)期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天達(dá)頂點(diǎn)，以后進(jìn)入平臺(tái)期，群體倍增時(shí)間平均約48 h。與對(duì)照組(control)相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ低濃度組(L-ASD，0.1 μmol·L－1)OB 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ中濃度組(M-ASD，1 μmol·L－1)和川續(xù)斷皂苷Ⅵ高濃度組(H-ASD，10 μmol·L－1)OB 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)明顯升高(P＜0.01)，提示大鼠骨髓MSCs在川續(xù)斷皂苷Ⅵ中、高濃度穩(wěn)定擴(kuò)增，未出現(xiàn)衰老征象，有較強(qiáng)的擴(kuò)增潛能。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Cells growth curve of akebia saponin D

2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過(guò)程中堿性磷酸酶(ALP)活性的影響與對(duì)照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ低濃度組對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為OB過(guò)程中第4、5、6天的ALP活性差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ中濃度組和川續(xù)斷皂苷Ⅵ高濃度組對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為OB過(guò)程中第4、5、6天的ALP活性明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn) Tab 1。

Tab 1 Effects of akebia saponin D on ALP activity in different concentrations of MSCs cells to osteoblasts during differentiation(mmol·L－1·min－1·g－1Pro，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 Incubation time/d 4 5 6 Control － 2.51 ±0.12 3.16 ±0.14 3.62 ±0.14 L-ASD 0.1 2.62 ±0.16 3.31 ±0.17 3.75 ±0.18 M-ASD 1 3.23 ±0.13＊＊ 3.49 ±0.16＊＊ 3.84 ±0.16＊＊H-ASD 10 3.75 ±0.15＊＊ 3.56 ±0.12＊＊ 3.98 ±0.15＊＊

2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過(guò)程中骨鈣素(OC)的影響 與對(duì)照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ低濃度組對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為OB過(guò)程中第4、5、6天的骨鈣素差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ中濃度組和川續(xù)斷皂苷Ⅵ高濃度組對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為OB過(guò)程中第4、5、6天的骨鈣素明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Effects of akebia saponin D on osteocalcin in different concentrations of MSCs cells to osteoblastsduring differentiation(μg·L－1，±s，n=8)

Tab 2 Effects of akebia saponin D on osteocalcin in different concentrations of MSCs cells to osteoblastsduring differentiation(μg·L－1，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 Incubation time/d 4 5 6 Control － 51.36±2.32 53.16±2.24 54.19 ±2.37 L-ASD 0.1 53.18 ±2.27 55.07 ±2.26 56.16 ±2.31 M-ASD 1 54.98±2.35＊＊ 56.48±2.34＊＊ 57.13 ±2.34＊＊H-ASD 10 55.38±2.39＊＊ 57.39±2.71＊＊ 58.64 ±2.17＊＊

2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過(guò)程中Cbfα1 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ低濃度組對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為OB過(guò)程中第5天的Cbfα1 mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ中濃度組和川續(xù)斷皂苷Ⅵ高濃度組對(duì)大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為OB過(guò)程中第5天的Cbfα1 mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn)Tab 3。

3 討論

干細(xì)胞可分為三種類(lèi)型:一類(lèi)是全能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞，來(lái)源于胚胎早期原始生殖細(xì)胞，可分化為機(jī)體所有類(lèi)型細(xì)胞;第二類(lèi)是多能干細(xì)胞;第三類(lèi)是專(zhuān)能干細(xì)胞。第二、三類(lèi)干細(xì)胞存在于成年組織中，又稱(chēng)成體干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞，可分化為一、二種類(lèi)型的分化細(xì)胞。傳統(tǒng)認(rèn)為骨髓MSCs的主要功能是參與造血干細(xì)胞生存和分化，近年發(fā)現(xiàn)還具有向多種細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的潛能，自體獲取的骨髓MSCs回輸后不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，體外基因轉(zhuǎn)染率高，骨髓MSCs成為組織工程、基因治療的研究熱點(diǎn)［8－9］。成年后長(zhǎng)骨骨髓腔內(nèi)以黃骨髓(含脂肪細(xì)胞多)為主，若以此為骨髓MSCs的來(lái)源，則脂肪細(xì)胞多，MSCs很少;幼年動(dòng)物骨髓腔內(nèi)以未分化幼稚細(xì)胞為主，本實(shí)驗(yàn)骨髓MSCs分離、純化選擇了具有多向分化潛能的幼年動(dòng)物的骨髓MSCs為誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的來(lái)源。

Tab 3 Effects of akebia saponin D on expression of Cbfα1 mRNA in different concentrations of MSCs cells to osteoblasts during differentiation(±s，n=8)

Tab 3 Effects of akebia saponin D on expression of Cbfα1 mRNA in different concentrations of MSCs cells to osteoblasts during differentiation(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 Cbfα1/β-actin/%Control － 6.58 ±2.12 L-ASD 0.1 8.03 ±2.49 M-ASD 1 10.27 ±2.64＊＊H-ASD 10 11.02 ±2.81＊＊

目前對(duì)于骨髓中MSCs的分離、純化、培養(yǎng)還沒(méi)有統(tǒng)一的方法，比較常用的方法是密度梯度離心法、貼壁細(xì)胞分離法、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法。實(shí)驗(yàn)中我們把密度梯度離心法與貼壁細(xì)胞分離法相結(jié)合，首先根據(jù)比重差別，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓MSCs，經(jīng)密度梯度離心后，能有效地將絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板除去，獲得純度較高的單個(gè)核細(xì)胞，然后利用貼壁細(xì)胞分離法，根據(jù)骨髓MSCs貼壁生長(zhǎng)而造血系細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的特性差異，隨換液棄除懸浮生長(zhǎng)的造血細(xì)胞，剩下的是貼壁生長(zhǎng)的MSCs，經(jīng)幾次傳代，對(duì)二者進(jìn)行完整分離，從而使MSCs得到進(jìn)一步純化。

MSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示為潛伏適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期，每個(gè)時(shí)期的細(xì)胞系都有其特性，從生長(zhǎng)曲線(xiàn)的形狀，判定骨髓MSCs的生長(zhǎng)繁殖潛力基本穩(wěn)定，細(xì)胞為均一的成纖維樣細(xì)胞，潛伏適應(yīng)期在第1～3天，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為第4～6天，以后進(jìn)入平臺(tái)期，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，群體倍增時(shí)間46 h，傳代周期約7 d，每傳代一次細(xì)胞增加約3.2倍，高、中濃度的川續(xù)斷皂苷Ⅵ與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)曲線(xiàn)有明顯差異。隨著成骨細(xì)胞分化的逐漸進(jìn)展，其增殖能力減弱，到成熟的成骨細(xì)胞不具備增殖能力［10］。ALP是主要分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞成熟、鈣化［11］。骨鈣素是骨質(zhì)鈣化必需的因子，維持骨組織的正常礦化［12］。ALP和骨鈣素分別是成骨細(xì)胞早期和中期分化的標(biāo)志物［13－14］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入誘導(dǎo)劑高、中濃度的ASD組，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具有與成骨細(xì)胞相似的形態(tài)和生長(zhǎng)特征，與對(duì)照組相比，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，骨鈣素含量增加，說(shuō)明ASD誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的作用較強(qiáng)。

核心結(jié)合因子α1(core-binding factor alpha 1，Cbfα1)是脊椎動(dòng)物成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，除了作為核蛋白與成骨細(xì)胞上的特異順式作用元件結(jié)合以激活骨鈣素表達(dá)外，還調(diào)節(jié)所有關(guān)鍵成骨細(xì)胞基因的表達(dá)，在成骨細(xì)胞分化中起主要作用。Cbfα1基因缺失沒(méi)有其它平行通路可取代Cbfα1的作用［15－16］。Cbfα1 還能控制分化的成骨細(xì)胞進(jìn)一步成骨，控制分化成骨細(xì)胞的成骨速率，調(diào)節(jié)骨鈣素基因(bgp)表達(dá)，bgp的表達(dá)僅限于分化完全的成骨細(xì)胞，該基因的啟動(dòng)子上存在2個(gè)成骨細(xì)胞特異順式作用元件OSE 1和OSE 2。胚胎發(fā)育時(shí)Cbfα1的表達(dá)限于成骨細(xì)胞，Cbfα1是骨生成最早和最特異的標(biāo)志，而作用于Cbfα1上下游的轉(zhuǎn)錄因子可能為非特異性的［17］。本實(shí)驗(yàn)研究表明，Cbfα1與骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程密切相關(guān)，中、高濃度的ASD可使該過(guò)程中Cbfα1 mRNA的表達(dá)加強(qiáng)，Cbfα1 mRNA的表達(dá)始于成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的早期，至第6天時(shí)達(dá)到高峰，并持續(xù)表達(dá)于成骨分化全過(guò)程中。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有促進(jìn)MSCs增殖和向成骨細(xì)胞分化的能力，并在基因水平上為篩選促進(jìn)骨形成的有效藥物提供了作用靶點(diǎn)，詳細(xì)的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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