氣相色譜法測定鹽酸法舒地爾中有機(jī)溶劑殘留量

方海燕 方學(xué)勤 劉元?jiǎng)?/p>

1.湖北省黃石市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所生測室，湖北 黃石 435000；2.湖北省黃石市世星藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 黃石 435003

鹽酸法舒地爾是一種具有廣泛藥理作用的新型藥物，它的分子結(jié)構(gòu)為5-異喹啉磺酰胺衍生物，為RHO激酶抑制物，它抑制了RHO激酶參與的細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、平滑肌細(xì)胞收縮、胞質(zhì)分裂的調(diào)節(jié)，從而抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。在日本1995年正式批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，用來防治慢性缺血性腦血管痙攣[1]。由于該藥在合成過程中需使用甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑，產(chǎn)品中的有機(jī)殘留量對人體是有害，故應(yīng)對原料藥中有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行控制。由于現(xiàn)有文獻(xiàn)中尚未發(fā)現(xiàn)這方面的研究，本試驗(yàn)根據(jù)ICH和 《中國藥典》2010年版二部對有機(jī)溶劑殘留量測定的指導(dǎo)原則[2]，并參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，采用氣相色譜法測定了鹽酸法舒地爾原料中的甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的含量，方法簡便靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

島津GC-14C氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器（FID），CS-Light色譜工作站，梅特勒AL204分析天平；毛細(xì)管色譜柱 SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）。

鹽酸法舒地爾（批號：20080601、20080602、20080603，自制），甲醇、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜均為色譜純，二氯甲烷為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

由于N，N-二甲基甲酰胺是高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，采用其色譜條件不能有效將甲醇、二氯甲烷進(jìn)行分離。因此，分別采用兩種程序升溫條件，測定甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺。FID檢測器，檢測器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度200℃，載氣為氮?dú)?，采用恒流模式，流速?2 mL/min，氫氣流速50 mL/min，空氣流速 500 mL/min，SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）毛細(xì)管柱，分流時(shí)間0.1 s，分流流速3 mL/s，進(jìn)樣量1 μL。采用島津CS-light氣相色譜工作站，色譜峰理論塔板數(shù)不低于5000，分離度大于1.5。

分析甲醇、二氯甲烷的程序升溫：初始柱溫55℃，平衡0.5 min，以40℃/min的速度升溫至70℃，平衡1 min，以 40℃/min的速度升溫至180℃，平衡3 min。

分析N，N-二甲基甲酰胺的程序升溫：初始柱溫50℃，平衡3 min，以20℃/min的速度升溫至180℃，平衡3 min。

圖1 甲醇、二氯甲烷對照品溶液圖譜

2.2 溶液的制備

2.2.1 甲醇、二氯甲烷溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液的制備 分別取甲醇、二氯甲烷適量，精密稱定，用二甲基甲酰胺（DMF）稀釋成1 mL約含甲醇300 μg、二氯甲烷60 μg的溶液，另加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具體制備為：取分析純苯約60 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加DMF并稀釋至刻度，振勻。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取鹽酸法舒地爾1.0 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用DMF稀釋至刻度，振搖使溶解，即得。

2.2.2 N，N-二甲基甲酰胺溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取N，N-二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1 mL中分別約含88 μg的溶液，另精密量取內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL置于該量瓶中，用20%甲醇稀釋至刻度，振勻。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具體制備為：取分析純N，N-二甲基乙酰胺約80 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，振勻。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 另取本品約0.1 g，精密稱定，取0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，置于10 mL量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，充分振搖。

圖2 甲醇、二氯甲烷供試品溶液圖譜

2.3 測定方法

分別取對照溶液和供試品溶液，按上述色譜條件測定，甲醇、二氯甲烷結(jié)果，見圖1、2；N，N-二甲基甲酰胺結(jié)果，見圖 3、4。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密稱取甲醇、二氯甲烷適量，用DMF稀釋成含甲醇 0.0657、0.6570、6.5700、65.7000、657.0000 μg/mL，含二氯甲烷 1.76、17.60、176.00、246.40、316.80 μg/mL， 取以上各濃度溶液10 mL，分別加入0.5 mL苯內(nèi)標(biāo)溶液，用20%甲醇稀釋成含 N，N-二甲基甲酰胺 0.166、1.660、16.600、66.400、83.000、99.600 μg/mL的溶液備用，取此系列濃度溶液10 mL分別加入0.5 mL N，N-二甲基乙酰胺內(nèi)標(biāo)溶液，取1 μL樣品直接進(jìn)樣以AR/AS為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），計(jì)算甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的回歸方程分別為Y=1.0122X+0.0029（r=1.0000）、Y=0.4387X+0.0002（r=0.9991）、Y=10.857X+0.056（r=0.9998）。結(jié)果表明甲醇在 0.0657～657.0000 μg/mL，二氯甲烷在 0.76～316.80 μg/mL，N，N-二甲基甲酰胺在0.166～99.600 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液，連續(xù)測定6次，結(jié)果甲醇溶液中苯/甲醇的峰面積的RSD為1.02%，二氯甲烷溶液中苯/二氯甲烷的峰面積的RSD為1.61%，N，N-二甲基甲酰胺溶液中苯/DMF的峰面積的RSD為3.13%，符合《中國藥典》2010年版規(guī)定的有機(jī)溶劑殘留內(nèi)標(biāo)法測定精密度的要求 （RSD不大于5%）。見表1。

2.6 最低檢測限的測定

圖3 N，N-二甲基乙酰胺對照品溶液色譜圖

圖4 N，N-二甲基乙酰胺供試品溶液色譜圖

取“2.4”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用逐步稀釋法，按上述色譜條件進(jìn)樣，測得甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的檢測限（S/N=3）分別為 0.0657、1.1000、0.0166 μg/mL。

表1 殘留溶劑測定精密度試驗(yàn)

2.7 回收率試驗(yàn)

2.7.1 甲醇、二氯甲烷回收率試驗(yàn)測定

分別量取甲醇、二氯甲烷對照儲備液0.5、4.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為濃度為12%、100%、120%的混合加樣溶液。分別精密稱取已知?dú)埩袅康墓┰嚻罚ㄅ枺?0080603）各0.1 g，分別加以上各濃度的混合溶液10 mL使其溶解，搖勻，分別依法測定，計(jì)算各有機(jī)溶劑的平均回收率。見表2。

表2 甲醇、二氯甲烷回收率測定結(jié)果

2.7.2 N，N-二甲基甲酰胺回收率試驗(yàn)測定

分別量取N，N-二甲基甲酰胺對照儲備液 4、5、6 mL，置10 mL量瓶中，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為濃度為80%、100%、120%的混合加樣溶液。分別精密稱取已知?dú)埩袅康墓┰嚻罚ㄅ枺?0080601）各0.1 g，分別加以上各濃度的混合溶液10 mL使其溶解，搖勻，分別依法測定，計(jì)算N，N-二甲基甲酰胺平均回收率，見表3。

表3 N，N-二甲基甲酰胺回收率測定結(jié)果

2.8 樣品測定

取鹽酸法舒地爾樣品3批，各約1.0 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液和DMF溶解并定容，搖勻，平行制備3份。加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液和20%甲醇溶解并定容，搖勻，平行制備3份。按上述色譜條件進(jìn)樣，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，取平均值作為測定結(jié)果。見表4。由表4可知，3批樣品的殘留溶劑均符合規(guī)定（殘留溶劑甲醇≤0.3%，二氯甲烷≤0.06%，DMF≤0.088%）。

表4 殘留溶劑檢測結(jié)果（%）

3 討論

3.1 進(jìn)樣方式的選擇

通常采用頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣的方法，由于N，N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)為180℃，不能采用頂空進(jìn)樣法，改用直接進(jìn)樣，但是N，N-二甲基甲酰胺出峰較晚，不能選用高沸點(diǎn)溶劑作溶媒，但如果選用低熔點(diǎn)溶劑作溶媒又干擾了甲醇及二氯甲烷的出峰，所以檢測3種殘溶不能共用同一種溶媒。因此，選用兩種溶媒，采用兩種不同的程序升溫，進(jìn)行測定樣品中甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺含量。

3.2 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)室曾選用不同極性及不同口徑的毛細(xì)管色譜柱，如 SE-54（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）、FFAP （25 m×0.32 mm，0.50 μm） 經(jīng)多次試驗(yàn)采用SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）柱，可使 DMF 達(dá)到較好的基線分離，基線平直，色譜峰峰型對稱，分離度較好，同時(shí)也能滿足甲醇及二氯甲烷的檢測要求。因此本次檢測采用的是毛細(xì)管色譜柱 SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm），此色譜柱為大口徑色譜柱。

3.3 殘留溶液含量計(jì)算方法的選擇

本文建立以添加內(nèi)標(biāo)物的方法，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算殘留溶液的含量。測定組分分離完全，各組分出峰時(shí)間靠近，原料藥溶液中各組分出峰保留時(shí)間與相應(yīng)物質(zhì)對照品溶液出峰保留時(shí)間一致，精密度及線性較為理想，添加組分回收完全。

綜上所述，本檢測方法操作簡便，經(jīng)濟(jì)可行，并已于近期通過了藥品監(jiān)督管理局的審核。

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