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    BrdU免疫組織化學(xué)染色方法的改進(jìn)(漂片法)

    2012-07-28 10:16:42郭晶晶單立冬
    關(guān)鍵詞:胰酶轉(zhuǎn)輪組織化學(xué)

    郭晶晶 單立冬 吳 鋼

    1.上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院普外科,上海 200431;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)與醫(yī)學(xué)心理學(xué)系,江蘇 蘇州 215123;3.上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科,上海 200040

    5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)是胸腺嘧啶核苷的類似物,在細(xì)胞周期的S期摻入到增殖或分裂細(xì)胞的核內(nèi),只要細(xì)胞不消亡,BrdU將永久地存留在胞核DNA中,且在體或離體都能通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)到,可用于標(biāo)記BrdU暴露期間進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞[1]。故BrdU陽(yáng)性細(xì)胞可被看作是具有增殖活性的細(xì)胞。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    動(dòng)物:SD大鼠,雌雄不拘,體重220~230 g,蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑:BrdU(Roche Diagnostic Co.)。

    1.2 分組

    踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)對(duì)成年大鼠海馬齒狀回細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)分兩組,①踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)組:轉(zhuǎn)輪速度為10 m/min,每天訓(xùn)練2 次(09:00,15:00),每次訓(xùn)練 30 min,連續(xù) 6 d;②對(duì)照組:動(dòng)物置于轉(zhuǎn)輪中,速度為0。放置次數(shù)與時(shí)間同運(yùn)動(dòng)組。在染色過(guò)程中每一組又分為三個(gè)亞組,分別為加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組。

    1.3 BrdU標(biāo)記

    踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)的第4天開(kāi)始給藥,于每次運(yùn)動(dòng)前1 h腹腔注射 BrdU(50 mg/kg,美國(guó) ROCHE 公司),2 次/d,連續(xù) 3 d。 末次給藥后24 h處死動(dòng)物,從前囟后3.3~5.1 mm作連續(xù)冰凍切片,進(jìn)行BrdU染色。

    1.4 BrdU免疫組織化學(xué)

    切片經(jīng)2 mol/L HCl(室溫30 min)變性,用0.01 mol/L PBS充分漂洗后轉(zhuǎn)入0.1%胰酶中(37℃15 min)消化后,0.01 mol/L PBS漂洗(5 min×3次),分別加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組,室溫下30 min,然后加入小鼠抗BrdU單克隆抗體(1∶200,Biosource)室溫孵育 16h,0.01mol/L PBS 漂洗(5min×3次),轉(zhuǎn)入羊抗小鼠二抗(1∶200,Vector)室溫孵育 2 h,再用 0.01 mol/L PBS漂洗(5 min×3次),移入親和素生物素試劑(avidin-biotin complex,ABC,1∶200)室溫孵育 2 h,最后用含0.03%H2O2的0.05%DAB 顯色 3~5 min,0.01 mol/L PBS終止顯色。常規(guī)脫水、透明、封片。鏡檢BrdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    隨機(jī)選取每只大鼠位置相同的5張不連續(xù)切片,光學(xué)顯微鏡下 (×200)計(jì)數(shù)每張切片雙側(cè)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層(granular cell layer,GCL)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞的均數(shù)作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。用SPSS 10.0軟件作方差分析(one-way ANOVA)檢測(cè)組間差異性。

    2 結(jié)果

    2.1 踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)對(duì)成年大鼠齒狀回細(xì)胞增殖的作用

    經(jīng)過(guò)6 d的踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后,各組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞見(jiàn)圖1。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),對(duì)照組為(22.55±1.91)個(gè)/切片,踏轉(zhuǎn)輪組為(57.89±1.90)個(gè)/切片,兩組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。由此可見(jiàn),踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)可增加BrdU陽(yáng)性細(xì)胞,促進(jìn)齒狀回細(xì)胞增殖。

    圖1 踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)6 d后海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

    2.2 不同的封閉液對(duì)組織片染色效果的影響

    末次給藥后24 h處死動(dòng)物,從前囟后3.3~5.1 mm作連續(xù)冰凍切片,將切片隨機(jī)分成三組。在染色過(guò)程中,這三組分別加入羊血清、胰酶抑制劑和牛血清白蛋白作為封閉液和終止胰酶作用的抑制劑。各組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞如圖2所示。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,三種方法均能使BrdU著色,但各組的本底顏色和非特異性著色程度不同:羊血清組中雖然陽(yáng)性細(xì)胞與非特異性著色細(xì)胞有明顯區(qū)別,但非特異性著色細(xì)胞顯色度較深,且遍布整個(gè)視野。胰酶抑制劑組陽(yáng)性細(xì)胞與非特異性著色細(xì)胞也有明顯差異,而且非特異性著色細(xì)胞顯色度較淺,整個(gè)本底相對(duì)較為干凈、清爽。牛血清白蛋白組幾乎見(jiàn)不到非特異性著色細(xì)胞,本底顏色非常淡。

    除了本底顏色和非特異著色的觀察外,筆者還重點(diǎn)觀察了組織切片的破損情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:牛血清白蛋白和胰酶抑制劑組無(wú)切片破損,而羊血清組有少部分腦片破損。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:羊血清組為(23.22±2.38)個(gè)/切片,胰酶抑制劑組為(22.54±2.12)個(gè)/切片,牛血清白蛋白組為(23.14±3.12)個(gè)/切片,各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    圖2 不同封閉液對(duì)BrdU免疫組織化學(xué)染色效果的影響

    自從20世紀(jì)末神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以來(lái),其目前已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。而研究在體或移植后的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化中常用的標(biāo)記新生細(xì)胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA(proliferating cell nuclear antige)[2-3],前兩者在細(xì)胞增殖時(shí)整合入細(xì)胞以后,即使在細(xì)胞靜止期仍能表達(dá);后兩者是細(xì)胞增殖過(guò)程中表達(dá)的內(nèi)源性蛋白,當(dāng)細(xì)胞處于靜止期時(shí),它們并不表達(dá)。因此,BrdU和3H是常用的追蹤細(xì)胞的標(biāo)記物,而B(niǎo)rdU的檢測(cè)又較3H更為方便、簡(jiǎn)單,所以BrdU是最為常用的標(biāo)記細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。

    豐富環(huán)境對(duì)神經(jīng)發(fā)生有影響,而在各種環(huán)境因素中,運(yùn)動(dòng)對(duì)其影響較為顯著[4-5]。本課題的前期研究建立了踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)的模型[6],并發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)發(fā)生的作用具有強(qiáng)度依賴性,這早于國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道[7-8]。故本課題選用運(yùn)動(dòng)作為促進(jìn)細(xì)胞增殖的方法,觀察了不同的染色方法對(duì)切片及結(jié)果的影響。

    組織切片BrdU染色時(shí),常用的方法有貼片法和漂片法。漂片法與貼片法相比有一定的優(yōu)點(diǎn):前者能使抗體從兩側(cè)滲透,更有利于抗體與抗原充分反應(yīng),相應(yīng)的在洗片時(shí),也能使未結(jié)合的抗體充分漂洗干凈;漂片法比貼片法所使用的抗體數(shù)量少,而且必要時(shí)抗體還可以回收,重復(fù)利用。標(biāo)本量大時(shí),漂片法比貼片法更省時(shí)、省力。但是,用漂片法進(jìn)行BrdU染色時(shí),由于在加入抗體前要用鹽酸和胰酶對(duì)腦片進(jìn)行預(yù)處理,經(jīng)過(guò)處理(尤其是胰酶處理)后,進(jìn)行染色的腦片極易破損,從而導(dǎo)致整個(gè)染色過(guò)程無(wú)法正常完成,或最終所得到的腦片極少。因此,在本實(shí)驗(yàn)中針對(duì)胰酶的消化作用,筆者分別選用了與二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白(牛血清白蛋白)及胰酶抑制劑來(lái)抑制(或終止)胰酶的消化作用。

    羊血清是免疫組織化學(xué)中常用的封閉液,但是,在本實(shí)驗(yàn)中并未取得預(yù)期的成果,雖然羊血清能終止胰酶的消化作用,但并未能有效地封閉非特異性染色。其原因目前仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。胰酶抑制劑(取自火雞蛋清)組和牛血清白蛋白組非特異性染色較少,尤其是牛血清白蛋白組。其原因可能是二者的成分單一,純度較高。

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