水蛭對局灶節(jié)段性腎小球硬化大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1蛋白表達的影響

楊 馨,劉 娜,張佩青,王海艷,陳 明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036)

水蛭是有破血、逐瘀、消癥功效的一味蟲類藥，其主要成分為蛋白質(zhì)及多肽分子，按藥理分為直接作用于凝血系統(tǒng)的活性成分、其他蛋白酶抑制劑組分，以及一些小分子化合物和微量元素[1]。水蛭制劑在腎臟疾病的治療中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[2]，在前期的實驗研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)水蛭能夠保護FSGS大鼠腎臟，減輕腎臟病理形態(tài)學改變，減少細胞外基質(zhì)(ECM)的重要組成部分Ⅳ型膠原蛋白和纖維粘連蛋白的表達，使局灶節(jié)段性腎小球硬化的進程得到延緩[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶類是調(diào)控ECM降解的重要酶類，參與ECM的重塑并穩(wěn)定組織的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境，其中MMP-9主要降解Ⅳ型膠原蛋白，TIMP-1是MMP-9的特異性抑制因子，MMP-9與TIMP-1的動態(tài)平衡在ECM的生理平衡中起關(guān)鍵作用[4-5]。本實驗觀察水蛭對FSGS大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1蛋白表達的影響，進一步探討其延緩局灶節(jié)段性腎小球硬化進程的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SPF級Wistar大鼠52只，180～220 g，實驗動物許可證號：SCXK-(吉)2011-0003；由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司提供。

1.2 主要藥品與試劑 水蛭江陰顆粒(0.5 g/袋：相當于飲片3 g)：江陰天江藥業(yè)有限公司。阿霉素：輝瑞制藥(無錫)有限公司；兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PV-6001兔抗鼠二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 2135型切片機：德國萊卡；CK-2型光學顯微鏡：CH型攝影顯微鏡：日本OLYMPUS；美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)。

1.4 模型制備、分組 實驗大鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組12只，假手術(shù)組12只，造模組28只。造模組行左腎切除術(shù)，術(shù)后大鼠無死亡，術(shù)后第7天經(jīng)尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，7 d后再將造模組大鼠隨機平均分為模型組(14只)與水蛭組(14只)。模型組與水蛭組于術(shù)后第35天經(jīng)尾靜脈再次注射阿霉素3 mg/kg。假手術(shù)組僅剝離腎臟脂肪包膜，并予等量的生理鹽水于相同時間點尾靜脈注射。正常組不作處理。

1.5 給藥 術(shù)后第14天，水蛭組采用水蛭0.9 g/(kg·d)灌胃；假手術(shù)組、模型組予等體積容量蒸餾水灌胃。共治療8周。

1.6 腎組織MMP-9、TIMP-1蛋白表達檢測 采用免疫組化PV6001二步法。分別于給藥后第4周末，第8周末測定腎組織MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。于400倍下以moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)攝片，以積分光密度(IOD)代表蛋白相對表達量，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達進行定量分析，IOD=陽性面積×平均光密度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織MMP-9 表達的檢測結(jié)果 第4、8周正常組與假手術(shù)組MMP-9在腎小球臟層上皮細胞、腎小管上皮細胞有少量表達，與正常組、假手術(shù)組比較，模型組和水蛭組MMP-9表達增多(P<0.01)。第4、8周水蛭組與模型組比較，MMP-9表達增強(P<0.01)。見圖1，表1。

圖1 各組大鼠4、8 周腎組織MMP-9免疫組化檢測結(jié)果(×400)

表1 各組大鼠4、8 周腎組織MMP-9表達光密度的比較

2.2 各組大鼠腎組織TIMP-1表達的檢測結(jié)果 第4、8周正常組與假手術(shù)組TIMP-1在腎小球上皮、內(nèi)皮、系膜、腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)有表達，與正常組、假手術(shù)組比較，模型組和水蛭組TIMP-1表達增多(P<0.01，P<0.05)。第4、8周水蛭組與模型組比較，TIMP-1表達減少(P<0.01)。見圖2，表2。

圖2 各組大鼠4、8 周腎組織TIMP-1免疫組化檢測結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠4、8周腎組織TIMP-1表達光密度的比較

3 討論

FSGS是原發(fā)腎病綜合征的一種病理類型，在我國發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，有調(diào)查顯示2005至2009年東北地區(qū)FSGS占原發(fā)性腎小球疾病的比例為4%[6]，華中地區(qū)FSGS所占成人原發(fā)腎病綜合征比例由從2009至2010年的5.8%增加到2011至2012年的14.7%[7]。治療上以激素和免疫抑制劑為主，但這些藥物的毒副作用不可忽視，中醫(yī)藥在減少蛋白尿及延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化方面，以及減少激素、免疫抑制劑副作用方面有獨特優(yōu)勢。目前研究認為，腎小球ECM的過度積聚是 FSGS 的重要病理改變[8]，ECM產(chǎn)生的主要來源是腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞和上皮細胞，當腎小球受到創(chuàng)傷時，其內(nèi)存在的使ECM降解的酶類則合成增加來促進ECM降解[9-10]。阿霉素致局灶節(jié)段性腎小球硬化模型可以較好的模擬FSGS的病變過程[11]。根據(jù)本實驗結(jié)果，筆者認為造模后隨著病變的逐漸進展，ECM合成增多，MMP-9為降解ECM，其表達開始逐漸增強，同時誘導TIMP-1表達相應(yīng)也增強，隨著時間延長，給藥8周末各造模組MMP-9表達有所減弱、但TIMP-1表達仍呈逐漸增強的趨勢，說明MMP-9出現(xiàn)表達減弱，可能是由于TIMP-1表達持續(xù)增多，MMP-9被逐漸消耗所致，其對ECM的降解作用減弱，故ECM增多，導致FSGS的發(fā)生。水蛭可以通過上調(diào)MMP-9、降低TIMP-1蛋白的表達，從而加強對ECM的降解，減輕ECM積聚；提示水蛭對ECM的主要降解酶系之一的基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)具有調(diào)控作用，可能是其干預(yù)FSGS進展的作用機制之一。