黃芪多糖對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1表達的影響

余維巍 黃驍燕 張 艷 夏 秦

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院綜合科，湖北 武漢 430030

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是具有呼吸道阻塞特征的慢性支氣管炎，其形成過程包括肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞增加，激活炎癥細胞釋放多種介質(zhì)進一步刺激細胞外基質(zhì)（ECM）沉積，導致呼吸道狹窄和呼吸道阻力增加。抑制炎性介質(zhì)的釋放和氣管的纖維化對防治COPD及其并發(fā)癥、改善患者的生活質(zhì)量具有重要意義。近年來，黃芪多糖在多種急、慢性炎癥中突出的免疫調(diào)節(jié)作用引起了人們的關(guān)注，本實驗擬采用觀察黃芪多糖對COPD大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）表達的影響，來進一步探討黃芪多糖對COPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

黃芪多糖 （四川百利藥業(yè)有限責任公司，批號：080606）；脂多糖（LPS）（Sigma 公司）；香煙（云南紅河卷煙廠軟乙香煙，尼古丁含量：1.3 mg；焦油含量：14 mg）；強的松片（西安利君沙制藥股份有限公司）；羥脯氨酸（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MMP-9、TIMP-1抗體（武漢博士德公司）。

1.2 模型的建立、分組與標本處理

健康Wistar雄性大鼠（華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供）40只，平均體重250～300 g，適應性飼養(yǎng)環(huán)境1周后采用隨機數(shù)字法將動物分為4組：正常對照組、COPD組、黃芪多糖組、強的松組，每組10只。①正常對照組：未作任何干預，每日用1 mL生理鹽水灌胃作為對照；②COPD組：第 1、16 天，氣管內(nèi)注入 1 g/L 的 LPS 200 μL/次，第 2～15天和第17～30天將大鼠放入有機玻璃熏箱內(nèi)被動吸煙，每天熏煙2次，每次20支香煙，時間持續(xù)1 h，2次熏煙間隔4 h，每天熏煙前0.5 h以1 mL生理鹽水灌胃作為對照；③黃芪多糖組：模型制備方法同COPD組，但每天熏煙前0.5 h以蒸餾水溶解黃芪多糖顆粒灌胃（40 mg/kg）；④強的松組：模型制備方法同COPD組，將強的松片研成粉末，加蒸餾水溶解，熏煙前0.5 h按6 mg/kg灌胃。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 取材方法 到第31天時，大鼠經(jīng)股動脈放血處死，打開胸腔結(jié)扎右主支氣管，取右下葉部分肺組織待檢測羥脯氨酸含量，余右肺組織以10%的中性福爾馬林固定，24 h以后石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色鏡檢。左肺用10%的中性福爾馬林固定20 min，常規(guī)脫水，透明，浸蠟包埋，待免疫組化檢測。

1.3.2 肺組織中羥脯氨酸含量測定 取大鼠肺組織用勻漿器在冰浴下制成10%勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清，按照羥脯氨酸試劑盒說明書進行操作，考馬斯亮藍法測定肺組織羥脯氨酸蛋白含量。

1.3.3 肺功能檢測 處死動物前采用AniRes動物肺功能儀進行大鼠肺功能測定。以3%戊巴比妥鈉70 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，將大鼠放進體掃描儀內(nèi)，連接動物肺功能儀，描記一段平靜呼吸后，在呼氣末以相當于潮氣量4倍的氣量充氣（相當于深呼氣），所引起的容積變化經(jīng)微機處理算出0.2 s用力呼吸量 （FEV0.2）、FEV0.2與用力肺活量比值（FEV0.2/FVC）以及吸氣阻力（Ri）、呼氣阻力（Re）。

1.3.4 肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白含量測定 取左肺石蠟切片（6 μm）作免疫組織化學染色（SP法）。免疫組化染色以細胞胞漿中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應，每組染色切片隨機選取10個視野，經(jīng)圖像掃描測定每組免疫反應陽性信號強度的平均吸光度（A），求出平均值，然后用統(tǒng)計學方法進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，對相關(guān)指標進行Spearman法直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理改變

光鏡下觀察，正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，COPD組大鼠肺泡壁增厚，間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，局部可見代償性肺氣腫，證實造模成功，黃芪多糖組及強的松組肺泡壁增厚較COPD組有所減輕，炎性細胞浸潤減少。

2.2 大鼠肺功能水平

與正常對照組比較，COPD組FEV0.2、FEV0.2/FVC均顯著減少，Re、Ri顯著增大（均 P ＜ 0.05）；與 COPD 組比較，黃芪多糖組和強的松組FEV0.2、FEV0.2/FVC均增多，Re、Ri減少（均P＜0.05），其中強的松組改善最為顯著。見表1。

表1 各組大鼠肺功能水平（）

表1 各組大鼠肺功能水平（）

注：1 cm H2O=0.098 kPa；與正常對照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，△P＜0.05

組別 FEV0.2（mL） FEV0.2/FVC Re（cm H2O） Ri（cm H2O）正常對照組COPD組黃芪多糖組強的松組7.25±1.285.15±0.74*6.22±1.02△6.98±1.21△90.11±5.9958.70±4.21*70.21±6.27△79.62±3.65△1.10±0.363.56±0.48*2.41±0.32△1.99±0.54△2.78±0.354.15±0.55*3.25±0.26△3.78±0.42△

2.3 大鼠肺組織羥脯氨酸含量

COPD組大鼠肺組織羥脯氨酸含量較正常對照組明顯增加（P＜0.01）；黃芪多糖和強的松干預后，羥脯氨酸含量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.4 大鼠肺組織中 MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 蛋白水平

COPD 組大鼠肺組織 MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平較正常對照組明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）；黃芪多糖和強的松干預后，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠肺組織羥脯氨酸、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1含量變化（）

表2 大鼠肺組織羥脯氨酸、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1含量變化（）

注：與正常對照組比較，#P＜0.01，*P＜0.05；與COPD組比較，##P＜0.01，△P ＜ 0.05

組別 羥脯氨酸（mg/g） MMP-9蛋白 TIMP-1蛋白 MMP-9/TIMP-1正常對照組COPD組黃芪多糖干預組強的松干預組2.35±0.287.25±0.74#5.98±0.29△4.97±0.32##25.11±3.2170.23±6.27*58.59±5.31△46.52±2.89△28.71±7.2139.60±3.65*31.31±5.02△30.22±4.39△0.91±0.201.98±0.45*1.56±0.37△1.32±0.24△

2.5 相關(guān)性分析

正常對照組、COPD組、黃芪組、強的松組肺組織MMP-9/TIMP-1水平與FEV0.2/FVC呈負相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=-0.411、-0.621、-0.684、-0.542，均 P ＜ 0.05）。

3 討論

COPD是一種以進行性的氣流阻塞和持續(xù)性的炎癥過程為特征的疾病，目前認為其病變早期是以炎癥細胞浸潤為主，后期表現(xiàn)為ECM沉積在氣道壁導致細支氣管壁的增厚和呼吸道重建[1-2]。ECM的降解和沉積失衡是導致氣道壁結(jié)構(gòu)異常構(gòu)建、肺實質(zhì)破壞和間質(zhì)增生的重要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組具有相同功能、結(jié)構(gòu)高度同源、依賴鋅離子的內(nèi)肽酶的總稱，MMP-9是MMPs家族的重要成員，能降解氣道和肺泡的ECM和基底膜，參與其重構(gòu)和炎細胞趨化，在COPD的發(fā)病中占重要地位[3]，TIMPs是MMPs的內(nèi)源性天然抑制因子，能與MMPs形成1∶1復合體抑制其活性，它有五種亞型，其中TIMP-1是活性最強的一種，能特異性抑制MMP-9的活性，TIMP-1還具有細胞生長因子樣作用，能使ECM沉積并抑制其降解，是氣道纖維化的標志，反映了呼吸道修復重塑的過程[4]。MMP-9/TIMP-1的平衡是維持ECM正常狀態(tài)所必須的，一旦平衡打破則出現(xiàn)病理狀態(tài)，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明呼吸道以炎癥反應為主，將引起組織破壞，MMP-9/TIMP-1比值下降，表面呼吸道以修復為主，過度降低（尤其是TIMP-1過度升高時）將出現(xiàn)纖維化可能[5]。本試驗中，COPD組MMP-9及TIMP-1均較正常組明顯升高，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 水平的升高與COPD 肺功能的下降、羥脯氨酸水平的升高有相關(guān)性，羥脯氨酸是反應組織纖維化程度的重要指標，上述結(jié)果提示MMP-9、TIMP-1在肺組織的損傷及纖維化方面起著重要作用。

COPD屬于中醫(yī)咳嗽、痰飲、喘癥的范疇，其病因與外邪入侵和內(nèi)傷有關(guān)，中醫(yī)理論認為肺主氣，朝百脈，乃是氣、血、津液匯聚之地，氣虛、血淤是COPD形成的重要病理基礎(chǔ)[6]，而中藥黃芪多糖是傳統(tǒng)補氣中藥，可補氣血，去淤散結(jié)，有助于氣血暢行，目前黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫方面的作用倍受關(guān)注，既往有試驗提示黃芪多糖可以抗纖維化[7]，故本試驗將黃芪多糖作為干預藥物，觀察其對肺組織病理、MPO、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達的影響，并將其與強的松作對比來觀測其療效。試驗結(jié)果顯示：黃芪多糖能使肺泡壁間隔增厚減輕，炎性細胞浸潤減少，并能部分改善局灶性肺氣腫，肺功能改善，使MPO、MMP-9、TIMP-1表達減少，MMP-9/TIMP-1比值減低，其作用與強的松有類似之處。據(jù)此筆者推論：黃芪可能通過降低肺組織羥脯氨酸的水平，抑制肺組織中MMP-9、TIMP-1的含量，降低MMP-9/TIMP-1比值來使ECM的合成和降解趨于平衡，這一作用有助于改善呼吸道的無效重構(gòu)和肺纖維化程度，因此肺功能得以改善。同時顯示，黃芪多糖及強的松對肺功能的改善和MMP-9/TIMP-1的降低呈正相關(guān)，與之前MMP-9/TIMP-1比值減低時肺損傷傾向于修復的觀點一致，但本試驗結(jié)果顯示，使用黃芪多糖和強的松后，MPO降低，與之前的MMP-9/TIMP-1比值降低肺部病變傾向于修復、有纖維化可能似乎有矛盾，但表2顯示，使用黃芪多糖后，MMP-9的減低幅度顯著高于TIMP-1，導致MMP-9/TIMP-1降低的主因是MMP-9的減低，提示黃芪多糖可能通過改善MMP-9/TIMP-1的比例來改善肺纖維化。對于黃芪多糖是通過何種途徑來影響MMP-9及TIMP-1的表達目前知之甚少，黃芪多糖對肺炎性因子表達的影響亦不清楚，這對進一步理解其作用機制有著重要意義，可作為下一步的研究目標。

目前對抑制MMP-9的表達及減輕肺損傷的藥物的研究正成為藥理學的研究熱點，一系列合成抑制物在動物試驗中已發(fā)揮明顯作用，但也因副作用而受到制約。中藥黃芪多糖毒副作用小，整體改善患者病情，本試驗進一步證實了其在COPD中的療效，提示黃芪多糖可能通過影響MMP-9/TIMP-1的比值來促進肺組織的修復。

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