黃芪、黨參乙醇提取物抗菌活性研究

段琦梅， 梁宗鎖*， 楊東風， 劉文婷

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100;2.陜西省中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物庫研究中心，陜西楊凌712100)

我國擁有豐富的藥用植物資源，其中很多藥用植物的作用都是通過抑菌作用來表現(xiàn)的［1-2］。從天然植物資源中尋找和開發(fā)綠色藥品既可以避免由于抗生素的廣泛使用而帶來的細菌耐藥性問題和藥物的不良反應(yīng)，又可以避免化學合成藥物的開發(fā)難度大及明顯的毒副作用，因此就顯得尤為重要，并且成為當前新藥發(fā)展的一種趨勢。目前，從天然物質(zhì)中尋找抗菌活性的物質(zhì)用于治療疾病越來越引起人們的關(guān)注［3-4］。

黃芪是我國傳統(tǒng)的補益用藥［5］。具有抗氧化、抗衰老、抗應(yīng)激、抗病毒、抗腫瘤的作用，對人體核酸代謝、細胞代謝、細菌及病毒感染等有顯著作用，對內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有廣泛的影響［5-6］。黨參具有健脾益肺、補中益氣的功能［7］，具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用［8-10］。黃芪和黨參中都富含黃酮、多糖、萜類、酚酸類、多種皂苷以及微量元素、氨基酸、亞油酸、膽堿、生物堿等［11－13］，其中許多化合物具有較強的生物活性。目前，關(guān)于黃芪、黨參提取物抗菌活性的研究少有報道，為了探討黃芪、黨參乙醇提取物的生物活性，本研究對黃芪、黨參藥材的乙醇提取物進行抗菌試驗研究，以期為充分利用黃芪、黨參藥材提供參考依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 供試材料 選用試驗材料經(jīng)西北農(nóng)林科技大學生命學院張躍進教授鑒定為黃芪Astragalus membranaceus和黨參Codonopsis pilosula。處理方法為:取清洗干凈的黃芪、黨參根部樣品置于50℃烘箱中干燥、粉碎并過40目篩，保存于密封容器中備用。

1.2 試驗菌株 所用的15種菌株分別為:金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus);綠膿假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa);大腸埃希氏菌(Escherichia coli);卡他布朗漢姆氏菌 (Branhamella catarrhalis);表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermdis);甲型溶血性鏈球菌 (Streptococcus hemolysis-α);乙型溶血性鏈球菌 (Streptococcus hemolysis-β);傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhi);肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae);福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri);肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae);變形桿菌(Proteus sp.);炭疽芽胞桿菌 (Bacillus anthracis);枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis);白色假絲酵母菌 (Candida albicans)。

以上15株試驗菌株凍干菌種均由中國藥品生物制品檢定所中國醫(yī)學細菌保藏中心提供。

1.3 主要試驗儀器及試劑 電熱恒溫培養(yǎng)箱;壓力蒸氣滅菌器;生物安全柜;96孔細胞培養(yǎng)板;電子天平;LB培養(yǎng)基 (美國Sigma公司);二甲基亞砜 (DMSO)，(西安化學試劑廠);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (北京陸橋技術(shù)有限公司);無支原體新生牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司)。

2 試驗方法

2.1 樣品的處理及樣品液配制 分別精密稱取3 g左右的黃芪、黨參粉末置于錐形瓶中，加入95%乙醇20 mL，在超聲波清洗器中超聲提取30 min，過濾，保留濾液，并對濾渣同樣處理后過濾，合并濾液，將提取液進行濃縮為干樣，黃芪的提取得率為4.365%，黨參的提取得率為1.984%。將黃芪、黨參醇提物干樣分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，對應(yīng)的黃芪相對提取物的質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，黨參相對提取物的質(zhì)量濃度為0.28 g/mL。

2.2 抗菌試驗 本試驗內(nèi)容中的試驗菌液配制、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度的測定 參照《中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》和《微生物學檢驗技術(shù)》中的相關(guān)章節(jié)，分別采用瓊脂微孔擴散法、連續(xù)二倍梯度液體稀釋法測定最小抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)，液體轉(zhuǎn)染法測定最小殺菌濃度 (Minimum bactericidal concentration，MBC)并略有改進［14-15］。

3 試驗結(jié)果

3.1 黃芪、黨參乙醇提取物對試驗菌的MIC

3.1.1 瓊脂平板微孔擴散法抗菌試驗 黃芪醇提物對卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有抑制作用。其中，對乙型溶血性鏈球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的作用尤為明顯。對每種菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.1、0.1、0.1、0.01、0.05、0.025、0.1、0.05、0.1 g/mL。

黨參醇提物對卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌、傷寒沙門氏菌、變形桿菌有抑制作用。

3.1.2 液體稀釋法抗菌試驗 黃芪醇提物MIC測定結(jié)果可知，黃芪醇提物對乙型溶血性鏈球菌的 MIC達10 mg/mL，在0.625～20 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯示對其余試驗菌株無抑制作用。黨參醇提物抗菌試驗結(jié)果表明，在1.7～56 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黨參醇提物對所用試驗菌株均無抑制作用。

3.1.3 黃芪、黨參醇提物對菌株的MIC 綜合液體稀釋法和瓊脂平板微孔擴散法抗菌試驗的結(jié)果，黃芪、黨參醇提物對15株常見標準菌株的MIC結(jié)果見表1。

3.2 黃芪、黨參醇提物對試驗菌的MBC 試驗結(jié)果表明，黃芪醇提物質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，黨參醇提物質(zhì)量濃度為0.28 g/mL時，對所有試驗菌均無滅活作用。

3.3 常用化學消毒劑、有機溶劑的抗菌試驗 為了使脂溶性的有效成分能夠充分溶解，在抑菌試驗中常采用有機溶劑助溶。為了研究采用有機溶劑在抗菌試驗中對試驗效果的影響，使試驗數(shù)據(jù)更科學、更具有參考價值，本研究設(shè)計如下試驗:選擇常用的有機溶劑乙醇、二甲基亞砜，研究乙醇、二甲基亞砜這些常見的有機溶劑在抗菌試驗中作為溶劑時，它們本身對細菌的抑制程度。

表1 黃芪、黨參乙醇提取物對15株標準菌株的MIC

試驗結(jié)果表明，高濃度乙醇對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有明顯的抑制作用。二甲基亞砜對細菌無抑制作用。

4 結(jié)論與討論

關(guān)于黃芪、黨參的抗菌活性曾有一些研究報道，其中，周建新等［16］對黃芪提取物作用于5種菌株進行研究;王俊淇等［17］對黨參脂作用于3種菌的抗菌活性進行了研究。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用體外抗菌試驗來研究黃芪、黨參乙醇提取物對常見15種細菌的抑菌活性，并且考慮試驗中所用溶劑對抗菌活性的影響。黃芪、黨參醇提物抗菌活性的試驗結(jié)果表明:黃芪醇提物對卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有抑制作用。其中，對乙型溶血性鏈球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的作用尤為明顯。對每種菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.1、0.1、0.1、0.01、0.05、0.025、0.1、0.05、0.1 g/mL。黨參醇提物不但對卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有抑制作用，同時對變形桿菌、傷寒沙門氏菌有抑制作用。對應(yīng)的最小抑菌質(zhì)量濃度除了對金黃色葡萄球菌的為0.14 g/mL外，其余的都為0.28 g/mL。

對于體外抗菌試驗的結(jié)果進行分析表明:黃芪提取物對試驗中所選用的9個試驗菌株有明顯的抑制作用，尤其是對乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和炭疽桿菌的作用較明顯，抑制作用表現(xiàn)得更為顯著。黨參醇提物對11個試驗菌株具有明顯的抑制作用。黃芪、黨參提取物中含有多種活性成分，包括有黃酮類、皂苷類等成分，有試驗表明，黃酮類和皂苷類均具有較好的抗菌、抑菌活性［18-20］。由于具有這些活性成分作為物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，黃芪、黨參醇提物表現(xiàn)出具有一定的抑菌作用。由于黃芪、黨參醇提物所含活性成分的復(fù)雜多樣性，本研究中僅對黃芪、黨參醇提物生物活性做了初步試驗，要進一步研究其醇提物中哪些成分具有抑菌活性及其抑菌機理，還需進一步進行深入的研究和探討。

以往對黃芪、黨參提取物進行的研究報道中，選用乙醇作為溶劑，這對試驗結(jié)果的準確性就有了一定的影響。為了讓所選擇的溶劑既能讓被研究物溶解又不能對所使用細菌起到抑菌作用，給抑菌試驗選擇合適的有機溶劑提供依據(jù)，本研究中設(shè)計了常用有機溶劑的抗菌試驗，試驗結(jié)果驗證了高濃度的乙醇具有較強抑菌及殺菌作用，其作用對象主要為革蘭陽性菌及部分革蘭陰性菌。75%乙醇在臨床上經(jīng)常單獨使用于皮膚消毒或作為脫碘劑與碘酊聯(lián)合。在抗菌試驗的設(shè)計中，不應(yīng)直接使用含有乙醇的樣本用于抗菌試驗，應(yīng)考慮乙醇提取物中乙醇的因素，避免乙醇對抗菌活性結(jié)果的影響。在本試驗中，將含乙醇的提取物樣本進行濃縮和干燥，再用對細菌、細胞生長無影響的二甲基亞砜 (DMSO)作溶劑來溶解提取物干燥品，避免乙醇對試驗結(jié)果的影響，使試驗結(jié)果更加真實可信。

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