李 懿, 何 佳, 趙庭周, 楊永紅, 蘇 豹, 馬 青, 韋建榮*
(1.云南白藥集團(tuán)股份有限公司,云南 昆明650032;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,云南昆明650201)
滇重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的干燥根莖,極具藥用價(jià)值,主要分布在我國(guó)滇、川地區(qū),具有清熱解毒、消腫止痛、平喘止咳、涼肝定驚之功效,多用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、跌打傷痛等癥[1-2]。現(xiàn)代化學(xué)研究,已從重樓屬植物中分離鑒定出50余種化合物,其中主要成分為甾體皂苷類,約占總化合物數(shù)目的80%,并含有甾醇、甾醇苷、黃酮苷、C21孕甾烷型苷等。甾體皂苷是其主要活性成分,其苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元[4-8]。本研究中重樓皂苷Ⅵ,Ⅶ,PA,H 屬于偏諾皂苷,重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ?qū)儆谑硎氃碥眨?-3],目前文獻(xiàn)對(duì)重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ研究較多,對(duì)重樓皂苷PA,H的研究相對(duì)較少?,F(xiàn)代藥理研究表明,重樓屬藥材具有抗腫瘤、抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抑制精子活性、抗細(xì)胞毒、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性[9]。
由于滇重樓繁殖率低,其傳統(tǒng)藥用部位根莖的自然生長(zhǎng)速度十分緩慢,從種子生長(zhǎng)為藥用商品,一般需10~15年,野生重樓資源再生較慢。近年來隨著藥用范圍不斷擴(kuò)大,對(duì)商品藥材需求量逐年增加,現(xiàn)有藥源遠(yuǎn)不能保障市場(chǎng)需要,僅靠野生資源已不能滿足工業(yè)化生產(chǎn),加之主產(chǎn)區(qū)亂采濫挖,忽視對(duì)滇重樓資源的保護(hù)和繁育,野生種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞,逐年的大量采挖已使野生滇重樓資源日趨枯竭,從而誘發(fā)滇重樓價(jià)格不斷攀升,在此情況下,摸清目前滇重樓資源情況具有重要意義;通過走訪滇重樓的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū),實(shí)地采集標(biāo)本,收集樣品,對(duì)不同產(chǎn)地的滇重樓資源進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),全面掌握目前滇重樓資源狀況,為有效保護(hù)和合理利用滇重樓資源收集資料并提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 藥材來源 分析樣品產(chǎn)自云南省境內(nèi)13個(gè)州(市、地區(qū)),涉及約75個(gè)采集點(diǎn),采集重樓屬植物植株292株,所有標(biāo)本具有標(biāo)簽及原植株生境照片,同時(shí)記錄來源、生境、氣候、地形、土壤、植被、海拔等相關(guān)信息,資料現(xiàn)收藏于云南白藥研究院;共獲得分析樣品69份,樣品經(jīng)云南白藥集團(tuán)股份有限公司趙庭周工程師、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊永紅教授鑒定,其中56份為重樓屬藥用植物滇重樓Paris polyphylla var.yunnanensis。
1.2 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100),自動(dòng)進(jìn)樣器,DAD檢測(cè)器。乙腈為色譜純,水為三蒸水。重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào) 111590-200402,111591-200402,111592-200402,111593-200402);重樓皂苷PA,H對(duì)照品,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所。
2.1 樣品處理 新鮮植株采集后除去泥沙等雜質(zhì),取根莖,減壓下40℃烘干,粉碎,細(xì)粉分包密閉后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 定量測(cè)定
2.2.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫,0~10 min,5% ~20%A,10~50 min,20% ~42%A,50~90 min,42% ~80%A,90~100 min,80%~95%A,洗脫時(shí)間為100 min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。
2.2.2 線性關(guān)系 分別取在40℃下減壓干燥的重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ,PA,H對(duì)照品適量,精密稱定,用甲醇制成0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣4、8、12、14、16、20 μL,得到回歸方程為:AⅠ=561.18 CⅠ+16.2,r=0.9998;AⅡ=539.73CⅡ+14.4,r=0.9994;AⅥ=645.0.7CⅥ+13.2,r=0.9992;AⅦ=462.4CⅦ+19.8,r=0.9995;APA=603.16CPA+20.1,r=0.9997;AH=617.69CH+14.6,r=0.9993。
2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率試驗(yàn) 6種重樓皂苷的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD范圍分別為 0.97% ~ 1.32%,1.34% ~ 1.69%,1.17% ~1.52%,表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好;重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ,PA,H 加樣回收率分別為:98.73%,98.17%,98.86%,98.01%,98.92%,98.33%,加樣回收率的 RSD范圍分別為 1.01% ~1.37%,0.74% ~ 1.21%,1.07% ~ 1.44%,1.15% ~1.68%,0.94% ~1.56%,1.33% ~1.82%。
2.2.4 樣品測(cè)定 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備按2010年版《中國(guó)藥典》一部重樓藥材項(xiàng)下含量測(cè)定的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行,色譜圖見圖1;每份樣品平行測(cè)定3次,結(jié)果取均值,各樣品重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ,PA,H測(cè)定的 RSD范圍分別為 1.43% ~1.88%,1.52% ~1.95%,1.23% ~1.92%,1.51%~2.16%,1.62% ~ 1.91%,1.68% ~2.07%,測(cè)定結(jié)果見表1。
圖1 6種重樓皂苷對(duì)照品及香格里拉維西縣永春鄉(xiāng)四保1號(hào)樣色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of six Paris polyphylla var.yunnanensis.for standard and sample
3.1 按照樣品產(chǎn)地和樣本量情況,以地理區(qū)域進(jìn)行歸類合并,對(duì)偏諾皂苷量(重樓皂苷Ⅵ,Ⅶ,PA及H之和)、薯蕷皂苷量(重樓皂苷Ⅰ,Ⅱ之和)以及6種皂苷量之和進(jìn)行比較。綜合來看,滇東南地區(qū)(紅河州)、滇西北地區(qū)(香格里拉、怒江、麗江)的樣品偏諾類皂苷量較高,滇西地區(qū)(大理州)樣品的薯蕷皂苷量較高,6種皂苷量之和較高地區(qū)為大理、紅河、滇西北、滇西地區(qū)及滇中地區(qū)(楚雄州)的部分區(qū)域,而滇南地區(qū)(西雙版納)重樓樣品的3個(gè)指標(biāo)較其他地區(qū)略低,這可能與這些地區(qū)特殊的氣候、自然地理?xiàng)l件導(dǎo)致植株生長(zhǎng)速度較快有關(guān)。
3.2 從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出,測(cè)定的56個(gè)樣品中,測(cè)出重樓皂苷Ⅰ的50個(gè),占樣品總數(shù)89.29%,測(cè)出重樓皂苷Ⅱ的51個(gè),占樣品總數(shù)91.07%,測(cè)出重樓皂苷Ⅵ的3個(gè),占樣品總數(shù)5.36%,測(cè)出重樓皂苷Ⅶ的54個(gè),占樣品總數(shù)96.43%,測(cè)出重樓皂苷H的52個(gè),占樣品總數(shù)92.86%,測(cè)出重樓皂苷PA的31個(gè),占樣品總數(shù)55.36%;結(jié)果表明,各地所產(chǎn)滇重樓,重樓皂苷含有量差異很大,同時(shí),從數(shù)據(jù)也可看出,各地所產(chǎn)滇重樓的6種重樓皂苷之間質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動(dòng)并無顯著性規(guī)律,呈現(xiàn)為隨機(jī)波動(dòng),但同一區(qū)域(地域)所產(chǎn)重樓,其各類皂苷量有一定的可比性及相似的變化規(guī)律,說明皂苷量與產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境等因素關(guān)系密切,鄒亮等[10]曾對(duì)不同產(chǎn)地滇重樓不同部位的4種重樓皂苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布狀況進(jìn)行
研究,結(jié)果表明滇重樓的品質(zhì)表現(xiàn)出一定的地域和生境依賴性,且各部位重樓皂苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在明顯差異,因此實(shí)施中藥材GAP管理,重視和發(fā)展地道藥材,規(guī)范地道藥材的種植,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和必要性;同時(shí)加強(qiáng)生物量?jī)?yōu)勢(shì)品種與皂苷量?jī)?yōu)勢(shì)品種的雜交育種研究,培育新的、經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高的栽培種,是有效保護(hù)和合理利用滇重樓資源的可行途徑。
表1 不同產(chǎn)地滇重樓中重樓皂苷測(cè)定(n=3)Tab.1 Determination of polyphyllin from different origins of Paris polyphylla var.yunnanensis.(n=3)
致謝:資源調(diào)查和樣品采集工作得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所大力協(xié)助,在此表示衷心的感謝。
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