星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選江西樟幫厚樸炮制工藝

霍慧君， 鐘凌云

(江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西南昌330004)

厚樸為常用中藥之一，來源于木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸 Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮［1］。厚樸的炮制方法歷代有10余種［2-5］，其中不乏地方炮制特色，江西樟幫厚樸的炮制方法就為其中之一［6］。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法［7-8］，以厚樸的主要有效成分厚樸酚、和厚樸酚為質(zhì)控指標(biāo)，對(duì)江西樟幫厚樸的炮制工藝進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Dionex UltiMate 3000);PDA-3000二極管陣列紫外檢測(cè)器;Chromeleon工作站。Sartorius萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，JZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，Raytek Raynger ST20紅外測(cè)溫儀(美國雷泰公司(raytek))。

1.2 試藥 厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110729-200411，中國藥品生物制品檢定所)，和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110730-201011，中國藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純，水為高純水。厚樸購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，生姜為市售品。

2 方法與結(jié)果

2.1 江西樟幫厚樸的制備 取定量的生姜加適量的清水搗汁，取姜汁與厚樸片拌勻。悶潤一夜取出，置鍋內(nèi)用小火炒，不斷翻動(dòng)，炒至藥物表面黑褐色為度，取出，晾涼后悶潤至出霜。

2.2 厚樸酚與和厚樸酚的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相甲醇-水(78 ∶22)，檢測(cè)波長294 nm，柱溫25℃，體積流量1.0 mL/min。HPLC圖見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)及樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard solution(A)，sample solution(B)

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含厚樸酚40 μg、和厚樸酚 24 μg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取厚樸粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，搖勻，密塞，浸漬24 h濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、4、6、8、10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，分別以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得和厚樸酚的回歸方程Y=1.0314X－0.0559，r=0.9999;厚樸酚的回歸方程 Y=1.7247X －0.1474，r=0.9999。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按照上述色譜條件連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積，和厚樸酚與厚樸酚的RSD分別為1.10%，0.65%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液，在相同的色譜條件下，在 0、6、12、18、24 h 分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，和厚樸酚與厚樸酚的RSD分別為1.33%，2.55%。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品5份，按2.2.3項(xiàng)下供試品的制備方法制備，分別測(cè)定，每次進(jìn)樣品 10 μL，和厚樸酚與厚樸酚 RSD分別為1.78%，1.22%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含有量的樣品0.1 g，精密添加一定量的和厚樸酚與厚樸酚對(duì)照品，按供試品的制備方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果平均回收率分別為 98.01%，97.34%，RSD 分別為1.39%，1.42%。見表1和表2。

表1 和厚樸酚加樣回收率試驗(yàn)Tab.1 Sample recovery test of honokio

表2 厚樸酚加樣回收率試驗(yàn)Tab.2 Sample recovery test of magnolol

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與效應(yīng)面分析

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取對(duì)厚樸有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較顯著的4個(gè)因素即姜的用量、炒制溫度、炒制時(shí)間、出霜時(shí)間為考察對(duì)象，采用 Design Expert 7.0 軟件［9-11］進(jìn)行優(yōu)化，以和厚樸酚量Y1、厚樸酚量Y2、OD值作為考察指標(biāo)。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.3 Fators and levels of central composite design

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 以所選因素姜的用量、炒制溫度、炒制時(shí)間、出霜時(shí)間進(jìn)行炮制工藝的研究，以和厚樸酚、厚樸酚的量為指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的“歸一值”［12］，各指標(biāo)“歸一值”求算幾何平均數(shù)，和總評(píng)“歸一值”。公式為:OD=(d1d2…dk)1/k(k為指標(biāo)數(shù))，和厚樸酚與厚樸酚的量均為越大越好，所以采用Hassan［13］方法進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”，dmax公式為:dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)。

采用Design expert 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合方程為 OD=0.37 －0.031A+0.042B+0.016C －0.034D －0.024AB+0.063AC － 0.062AD+2.500E －003BC+0.052BD+0.041CD －0.096A2+0.16B2+0.069C2－ 0.17D2，R2=0.7478，P=0.0168。結(jié)果見表4。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Central composite and results

2.3.3 曲面圖分析 以擬合的回歸方程為數(shù)學(xué)模型，利用Design Expert 7.0軟件分別繪制各因變量曲面圖，見圖2～圖7。得到優(yōu)化的工藝為姜的用量15.26%，炒制溫度120℃，炒制時(shí)間12 min，出霜時(shí)間 7.38 d。

圖2 A和B對(duì)OD值的效應(yīng)面圖Fig.2 A and B on the effects of the value OD

圖3 A和C對(duì)OD值的效應(yīng)面圖Fig.3 A and C on the effects of the value OD

圖4 A和D對(duì)OD值的效應(yīng)面圖Fig.4 A and D on the effects of the value OD

2.3.4 最佳工藝的驗(yàn)證 最優(yōu)工藝確定為姜的用量15%，炒制溫度120℃，炒制時(shí)間12 min，出霜時(shí)間7 d。重復(fù)做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，OD值為0.69，預(yù)測(cè)值為0.67，偏差為(0.69 －0.67)/0.67 ×100%=2.99%，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值偏差較小，表明工藝預(yù)測(cè)性良好。

圖5 B和C對(duì)OD值的效應(yīng)面圖Fig.5 B and C on the effects of the value OD

圖6 B和D對(duì)OD值的效應(yīng)面圖Fig.6 B and D on the effects of the value OD

圖7 C和D對(duì)OD值的效應(yīng)面圖Fig.7 C and D on the effects of the value OD

3 討論

在炮制工藝的篩選過程中，需要同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。目前，常用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，但該兩種方法實(shí)驗(yàn)精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差。本試驗(yàn)采用了星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，能更好地體現(xiàn)各因素、指標(biāo)與效應(yīng)值的關(guān)系，同時(shí)星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得的信息量更大，更直觀。因此，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選江西樟幫厚樸的炮制工藝，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值較接近，結(jié)果較理想，達(dá)到了優(yōu)選炮制工藝的目標(biāo)。

厚樸是我國特有的珍貴中藥材，來源主要以野生資源為主，因資源過度消耗，厚樸已被列為國家二級(jí)保護(hù)中藥材，因此，急需尋找和擴(kuò)大新的藥用資源。本實(shí)驗(yàn)選取江西地方炮制特色的江西樟幫姜厚樸進(jìn)行研究，在此研究基礎(chǔ)上，一方面進(jìn)一步闡明地方特色炮制方法作用機(jī)制，為地方特色炮制品種的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù);另一方面，也可指導(dǎo)地方特色姜厚樸炮制工藝的規(guī)范化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，為特色炮制品種的規(guī)?；a(chǎn)、擴(kuò)大藥用資源奠定基礎(chǔ)。

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